马金凤，刘雪儿，杨成德，李统华，金梦军

(甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

土壤微生物是地下生态系统中重要的生物因子，对农业生态系统的能量流动、物质循环及稳定性有重要作用，其受根系分泌物的影响，根际土壤微生物种类和数量具有强烈的根际效应[1]。越来越多的证据显示[1]，根际土壤微生物的数量、种类、代谢活性及微生物间的相互作用决定着植物的健康状况，植物与其生长的土壤之间存在反馈调节的关系，且部分土壤细菌具有固氮、溶磷，促进植物生长、抗逆境、抗病虫害和生物修复等多方面功能，使植物受益。目前，植物病害主要利用化学农药防治，尽管效果良好，但化学防治会引起植物病原抗药性和农药残留等问题，造成了环境污染和生态破坏[2]，而生物防治既可取得良好的防治效果，又能克服诸多缺点，已成为目前研究热点。其中，利用生防细菌防治植物病害是生物防治的一个主要内容。生防细菌防治植物病害发生发展的一个重要机制是产生拮抗物质[3]，且拮抗物质种类多，作用范围广谱。近年来有关植物病害生防细菌的研究越来越多，特别是东祁连高寒草地牧草内生细菌拮抗功能有较多报道[4-6]，但是对青海高寒极端生境土壤细菌的抑菌能力如何，相关报道较少。因此，试验拟采用平板对峙法评价青海高寒草地青藏苔草根围土壤细菌的拮抗能力，结合形态特征并利用16S rDNA基因序列对其进行鉴定，以期为高寒草地微生物资源开发利用提供依据，也为微生物菌剂的研发提供菌种资源。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 分离自青海高寒草地青藏苔草根际的土壤细菌；供试病原菌为番茄早疫病菌、马铃薯坏疽病病菌、马铃薯炭疽病菌和马铃薯枯萎病菌，由甘肃农业大学植物病理实验室提供。

1.1.2 供试培养基 牛肉膏蛋白胨(NA)培养基和Luria-Bertani(LB)培养基用于菌种的纯化和保存；马铃薯葡萄糖(PDA)培养基用于植物病原真菌的培养和对峙培养试验[7]。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤细菌的分离和纯化 将10 g土壤样置于90 mL无菌水中，在28℃的摇床上振荡30 min，浓度梯度稀释，取稀释的土壤悬液0.1 mL涂布在固体LB平板上，在28℃条件下培养48 h，挑取培养特征明显相异的单个菌落，划线于LB平板进行纯化，纯化后于4℃保存备用。

1.2.2 土壤细菌的培养性状及形态观察 制备LB培养基，通过划线培养菌株，2 d后观察平板上菌落形状、大小和颜色，18～24 h菌龄进行革兰氏染色，并进行显微观察、拍照和测量30个菌体的大小[7-10]。

1.2.3 拮抗功能评价 以4种病原菌为指示菌，采用对峙培养法评价拮抗功能。在25℃下将4种指示菌分别在PDA平板上活化培养7 d，土壤细菌在NA培养基上活化培养24 h，用直径为6 mm的打孔器在病原真菌平板上打取指示菌菌饼并接入PDA平板中央，再将土壤细菌点接在距菌饼2.5 cm处，每平板接4点，另在距菌饼2.5 cm处点接无菌水做对照，重复3次，于28℃培养5 d后用十字交叉法测量抑菌圈直径并计算抑菌率，根据抑菌率评价拮抗功能[7-10]。

抑菌率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.6)]×100%

1.2.4 16S rDNA序列鉴定 按天根生化科技有限公司提供的试剂盒(离心柱型细菌基因组DNA抽提试剂盒；目录号DP302)提取DNA，采用细菌16S rDNA通用扩增引物27 F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′进行PCR扩增。扩增体系为 DNA模板2 μL，MasterMix 25 μL，1492R 2 μL，27F 2 μL，ddH2O 19 μL。反应条件为：95℃预变性4 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，30个循环；72℃延伸10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳纯化的PCR产物送武汉金开瑞生物工程有限公司进行测序，将所得序列在NCBI的GenBank中进行Blast对比，选取与各菌株相似性较高的细菌菌株的16S rDNA序列，用Mega(7.0)软件中的邻接法构建系统发育树，明确系统发育信息。

1.3 数据分析

试验数据运用 Excel 2010和Mega 7.0软件进行处理比对。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌的分离和纯化

对青海高寒草地青藏苔草根围土壤细菌分离培养和纯化，其土壤细菌含菌量为1.8×107CFU/g，细菌数量丰富，但根据培养性状共分离到8株细菌，种类较单一，分别编号为1T1、1T2、1T3、1T4、1T5、1T6、1T7和1T8，其中1T5在28℃下经几次转接后不能生长。

2.2 土壤细菌的形态观察

2.2.1 培养形状观察 1T1：菌落直径1.5 mm，呈不规则圆形，皱纹状凸起，边缘不整齐，不透明，无光泽，较干燥，白色；1T2：菌落直径1.8 mm，呈圆形，稍凸起，边缘整齐，不透明，有光泽，乳白色；1T3：菌落直径2 mm，呈圆形，乳状凸起，边缘整齐，不透明，无光泽，粗糙，较干燥，乳白色；1T4：菌落直径2.5 mm，呈不规则圆形，边缘不整齐，表面褶皱，中心凹陷，呈草帽状，不透明，无光泽，白色；1T6：菌落直径1 mm，呈圆形，边缘整齐，菌落稍凸起，不透明，有光泽，乳白色；1T7：菌落直径1.5 mm，呈圆形，边缘整齐，较平展，不透明，有光泽，乳白色；1T8：菌落直径3 mm，呈圆形，边缘整齐，较平展，不透明，有光泽，乳白色(图1)。

2.2.2 菌体形态观察 7株土壤细菌均呈革兰氏阳性(图2)， 1T8菌体为球形，直径为2.25 μm，其余均为杆状，其中1T2菌体最长，达9.07 μm，宽为2.46 μm，1T7最短，长为2.88 μm，宽为1.07 μm，其他菌株长和宽均介于两者之间(表1)，表现出明显的形态多样性。

表1 土壤细菌的形态特征

图1 土壤细菌菌落形态Fig.1 The conoly characteristics of soil bacteria

图2 土壤细菌的革兰氏染色Fig.2 The gram stains of soil bacteria

2.3 拮抗功能评价

结果表明，土壤细菌1T4对供试病原真菌均有拮抗作用， 1T8对番茄早疫病菌和马铃薯坏疽病菌有拮抗作用(图3，4)，其中1T4和1T8对番茄早疫病菌的抑菌率分别为67.1%和65.7%，对马铃薯坏疽病菌的抑菌率分别为61.4%和54.3%；1T4对马铃薯枯萎病菌和马铃薯炭疽病的抑菌率分别为62.9%和75.7%；1T1、1T2、1T3、1T6和1T7对4种指示菌没有拮抗作用(表2)。

表2 7株土壤细菌对4种病原菌的抑菌率

图3 1T4和1T8对番茄早疫病菌的拮抗作用Fig.3 The antagonism of 1T4 and 1T8 against Alternaria solani

图4 1T4和1T8对马铃薯坏疽病菌的拮抗作用Fig.4 The antagonism of 1T4 and 1T8 against Phoma foveata

2.4 16S rDNA序列鉴定

采用细菌16S rDNA通用引物，对有抑菌作用的细菌进行PCR扩增，并将细菌扩增结果送至武汉金开瑞生物工程有限公司进行测序，测序结果与GenBank数据库进行Blast对比，选择与对比菌株同源性大于99%的菌株，使用MAGE7软件构建系统发育树。结果显示，在系统发育树中1T1与Pseudomonascorrugata(MF077203.1)的同源性达 100%，且聚于同一分支上(图6)，结合形态特征将1T1初步鉴定为Pseudomonascorrugata；1T3与Pseudomonasbrassicacearum(KX984045.1)的同源性达99%，且聚为一类，初步鉴定为Pseudomonasbrassicacearum；1T4与解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens的两个菌株MG937572.1和KY271752.1的同源性达99%，且聚为一类，初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens；1T2，1T6和1T8与腐生葡萄球菌Staphylococcussaprophyticus的两个菌株CP02209 3.2和CP014113.2的同源性达99%，并聚为一类，初步鉴定为腐生葡萄球菌Staphylococcussaprophyticus。

图5 青藏苔草根围土壤细菌系统发育树Fig.5 16SrDNA phylogenetic tree of soil bacteria

3 讨论

目前报道的生防细菌主要集中在类芽孢杆菌[11]、假单胞菌[12]和芽孢杆菌[13]等，如枯草芽孢杆菌C-22对棉花炭疽病菌、枯萎病菌、立枯病菌、黄萎病菌、棉花疫霉病菌和棉花叶斑病菌均有较好的抑制作用[14]；枯草芽孢杆菌OBS -2对尖镰孢香草兰专化型腐皮镰孢菌产生明显的拮抗带，具有实际应用价值[14]。试验从青藏苔草根围土壤细菌分离到的1T4病原鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，对番茄早疫病菌、马铃薯坏疽病菌、马铃薯枯萎病菌和马铃薯炭疽病菌均有拮抗能力，抑菌率在61.4%，与报道的芽孢杆菌对植物病原真菌具有较强拮抗能力的结果一致[11,15]。芽孢杆菌能够抑制的植物病害比较全面，包括植株的各个部分，例如植物地上部分的枝叶、果实及地下部分的根部等[16]，芽孢杆菌属被研究用作生防菌剂的菌种有很多，其中被报道较多的有解淀粉芽孢杆菌[17]。肉桂醛[18]、广藿香精油[19]、木犀草素[20]等对金黄色葡萄球菌的抑菌作用及抑菌机制方面的报道较多，而葡萄球菌抑菌作用的研究较少，试验将1T8初步鉴定为腐生葡萄球菌，且其对番茄早疫病菌和马铃薯坏疽病菌的抑菌率分别为65.7%和54.3%。从生防菌分离的区域分析，植物根际土壤仍然是生防菌分离的重点区域[14]，但有关极端环境土壤中生防菌的报道较少，因此，研究以马铃薯坏疽病菌、马铃薯炭疽病菌、马铃薯枯萎病菌和番茄早疫病菌为指示菌，评价青海高寒草地极端生境青藏苔草根围土壤细菌的拮抗能力，为高寒草地微生物资源开发利用提供依据，也为微生物菌剂的研发提供菌种资源。

4 结论

从青海高寒草地青藏苔草根围土壤样品中分离到8株土壤细菌，其中1T5在28℃下经几次转接后不能生长，解淀粉芽孢杆菌1T4对番茄早疫病菌、马铃薯坏疽病菌、马铃薯炭疽病菌和马铃薯枯萎病菌的抑菌率分别为67.1%、61.4%、75.7%和69.2%；腐生葡萄球菌1T8对番茄早疫病菌及马铃薯坏疽病菌的抑菌率分别为65.7%和54.3%。试验结果表明高寒草地牧草根围土壤细菌中具有良好抑菌能力的菌株，是一个巨大的微生物资源库。