吴 霞，朱小芳，马彩玲，杨亚贤，吕小芳，马宏萍，刘长仲，钱秀娟

(甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes，EPN)是体内携带具病原性的共生细菌，能使节肢类动物发病并死亡的一类线虫[1]，是对靶标昆虫具较高控制效能的生防因子。利用昆虫病原线虫防治害虫其优点为寄主范围广、可以人工大量繁殖、操作简单、用常规的喷洒装置或冲洗系统即可使用；线虫可以主动寻找寄主，对土栖和隐蔽的钻蛀性害虫效果好；线虫对环境安全，可与一些杀虫剂混用[2-4]。昆虫病原线虫不仅作为室内研究的对象，并作为替代化学杀虫剂的环境友好型生防因子，被人们所接受和应用，如美国佛罗里达州每年大约有25 000 hm2柑橘类植物施用昆虫病原线虫[5-7]。

昆虫病原线虫营自由生活阶段，要面临各种非生物胁迫，包括高温、低湿、紫外辐射(UV-B)、化学感应、土壤纹理等[8]；在实际应用中，决定昆虫病原线虫对害虫的控制效果的关键因子之一，是在各种非生物因子的胁迫下，EPN能否在田间建立种群[9-10]。因此，研究非生物胁迫对昆虫病原线虫的影响，具有重要意义。EPN多分布于相对湿润的地区，尤其分布于沿海沿江地区，相对湿度较低(50.5%)时，在36 h内会被致死[9,11]，充分说明低湿胁迫是影响昆虫病原线虫种群及其分布的重要因子；另一方面，昆虫病原线虫对隐蔽性害虫的田间应用广泛，而其对叶面害虫的防治，有较好的控制效能，但在田间控制效能会有所降低，其影响原因就是低湿胁迫[11]。

甘肃省大部分地区干旱少雨，在大田条件下昆虫病原线虫对叶面害虫防治效果不显著，分析低湿胁迫对昆虫病原线虫生物学特性的影响，是提高其控制效能和扩大其应用范围的关键因子[12-15]。因此，了解昆虫病原线虫对低湿胁迫的适应性，对昆虫病原线虫在干旱地区的应用有着重要的意义，且可以加大甘肃省土著昆虫病原线虫的应用。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试寄主昆虫大蜡螟。试验用5龄幼虫，平均质量为0.3 g，使用前需经滞育处理防止其吐丝，化蛹[16-17]。

昆虫病原线虫为异小杆线虫Heterorhabditismegidis0627M、H.brevicaudis0641TY、H.marelatu06 39G；

斯氏线虫Steinernemafeltiae0619HT、S.bicornutum0631PG、S.affine0619M、S.kraussei0657L、S.karii0663YC，均由甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室提供。

昆虫病原线虫均用White trap法，由大蜡螟老熟幼虫培养、繁殖，试验用的感染期线虫(Infectivejuveniles，缩略为IJs)均新鲜培养，并用0.2%柳硫汞进行表面消毒，贮存于4℃备用。

1.2 试验方法

1.2.1 昆虫病原线虫的扩繁 参照文献[1]的方法进行。于相同规格的培养皿中，底部垫两层滤纸，每皿放入10头大蜡螟，将线虫悬浮液用移液枪移至培养皿；每隔8 h观察大蜡螟的死亡情况，将死亡的大蜡螟移入扩繁收集盘中收集，备用。

1.2.2 低湿处理后线虫存活率的测定 在直径为90 mm的培养皿内垫两层滤纸，加适量水使其湿润，将1 mL线虫悬浮液(1000 IJs/mL)移入，置于相对湿度为50.5%，温度25℃的小空间湿度控制器中，低湿胁迫处理5，7及9 h后置于50.5%湿度条件复苏，每处理重复10次；复苏24 h后检查线虫存活情况并计算存活率；统计分析数据，筛选出经不同时长低湿处理，存活率高的昆虫病原线虫品系。

1.2.3 低湿处理线虫复苏后对大蜡螟的致病力的测定 采用改良的ONE ON ONE法测定。于24孔板中，每孔放2 g经灭菌的细沙，加无菌水使其含水量为15%(w/w)，每孔放1头大蜡螟Galleriamellonella5龄幼虫，将筛选出存活率较高的线虫品系置于滴入(剂量30 IJs/孔)不同的线虫品系为不同处理，以未经低湿处理的线虫作对照，每处理重复30次，置(25±1)℃ 昼/(18± 1)℃ 夜；8 h 昼/16 h 夜；RH 80%条件下恒温箱内。每隔8 h检查大蜡螟的死亡情况并做记录，比较不同湿度昆虫病原线虫对大蜡螟致病力的影响；统计分析数据，得出不同时长的低湿处理对大蜡螟致病力的变化。

1.2.4 低湿处理线虫复苏后对大蜡螟的生殖力测定 采用以大蜡螟为寄主昆虫的White Trap繁殖法。将筛选出存活率较高的线虫品系置于培养皿中，培养皿垫滤纸并使其湿润，每个培养皿中加入8头大蜡螟及经低湿处理的昆虫病原线虫1 000头，以未经低湿处理的线虫作对照，3次重复。每隔8 h检查大蜡螟的死亡情况并称重，放入线虫扩繁收集盘中，收集并计算每克大蜡螟产生的线虫数量。测定低湿处理对昆虫病原线虫生殖力的影响。

2 结果与分析

2.1 低湿胁迫对昆虫病原线虫存活率的影响

不同种类或品系昆虫病原线虫在低湿条件下，其存活率不同。S.feltiae0619HT、S.bicornutum06 31PG、S.affine0619M、S.kraussei0657L、S.karii0663YC、H.megidis0627M、H.brevicaudis0641TY、H.marelatu0639G 8种昆虫病原线虫经过低湿条件的处理，3种异小杆线虫的存活率较5种斯氏属线虫低，说明异小杆线虫抗低湿胁迫能力较斯氏线虫弱，其中S.kraussei0657L抗低湿胁迫能力最强。

图1 低湿处理下昆虫病原线虫的存活率Fig.1 Effects of low humidity stress on survival rate of entomopathogenic nematodes

通过对8种昆虫病原线虫低湿处理7 h 后，发现其中5种斯氏属线虫0619HT、0631PG、0619M、0657L、0663YC的存活率均高于72.5%，与其他存活率均低于50%的3种异小杆属线虫0627M，0641TY和0639G相比，有显著性差异(P<0.05)。其中，斯氏属线虫0619HT、0631PG两种的存活率低于80%，与0619M、0657L、0663YC 3种存活率均高于85%的线虫相比，有显著性差异(P<0.05)。经9 h低湿胁迫处理后，斯氏属线虫仍有较高的存活率且高于70%，0657L的存活率仍是80.3%，且明显高于供试的其他4 种斯氏属线虫，且有显著性差异(P<0.05)；异小杆属线虫在经过7 h 低湿胁迫处理后，0627M的存活率为37.6%，与0641TY和0639G有显著性差异(P<0.05)，其存活率分别为3.8%和7.7%；在对异小杆属线虫0639G，0641TY和0627M低湿胁迫处理9 h后，0639G 和0641TY全部死亡，0627M存活率7.5%，3种之间没有显著性差异(P>0.05)。

2.2 低湿胁迫对昆虫病原线虫致病力的影响

据对昆虫病原线虫存活率受低湿胁迫处理影响的研究结果，对筛选出较抗低湿胁迫的5种斯氏属线虫0619HT、0631PG、0619M、0657L、0663YC进一步研究低湿胁迫对其致病力的影响。

结果显示，先将侵染大蜡螟的线虫经过低湿胁迫处理后复苏，再对大蜡螟进行侵染，线虫对大蜡螟的侵入率均有不同程度的下降，而致死率只有S.affine0619M下降，其余4种无明显变化。经9 h 低湿处理后再复苏，大蜡螟在被5种斯氏线虫侵染48 h之后，用0619HT、0631PG、0657L和0663YC侵染大蜡螟时，供试大蜡螟全部死亡，即累积死亡率均为100%，与没有经过低湿处理的对照组没有显著性差异(P>0.05)，而0619M为75%，和对照有显著性差异(P<0.05)；5种线虫对大蜡螟的侵入率与对照组相比均下降，其中0663YC下降最明显，与0631PG、0619M、0657L有显著性差异(P<0.05)。综上所述，经过低湿处理，昆虫病原线虫的侵入率会降低，但是对其致病力除0619M外，没有显著影响(图2)。

2.3 低湿胁迫对昆虫病原线虫生殖力的影响

经低湿胁迫处理后，S.felitiae0619HT和H.megidis0627M的生殖力均有不同程度的下降，但各处理与对照组比较，生殖力差异不显著(P>0.05)。不同的辐射时长，除H.megidis0627M经7 h胁迫处理

图2 5种斯氏线虫经低湿处理复苏后的致死率和侵入率Fig.2 Effects of low humidity stress on fatality rates and infection rates of 5 species of Steinernema

后生殖力与对照存在差异外，其余处理均无显著差异(P>0.05)。说明低湿胁迫对昆虫病原线虫生殖力无显著影响。不同种类昆虫病原线虫，其生殖力变化趋势不同。S.felitiae0619HT随低湿胁迫处理时间增加，其生殖力上升。S.felitiae0619HT经过低湿处理5 h后，产生的线虫数为33 693.48条/g，线虫生殖力较对照组下降22 717.60条/g，经过低湿处理7 h后，产生的线虫数为39 542.80条/g，线虫生殖力较5 h上升了5 849.32条/g，经过低湿处理9 h后，产生的线虫数为81 547.18条/g，线虫生殖力较7 h上升了42 004.38条/g；而H.megidis0627M随低湿胁迫处理时间增加，其生殖力下降，经低湿处理5 h后，产生的线虫数为48 278.96条/g，生殖力较对照组下降了6 357.96条/g，H.megidis0627M随低湿胁迫处理时间增加，其生殖力有下降趋势。说明不同昆虫病原线虫的生殖适应能力经低湿胁迫处理后发生变化。低湿胁迫对S.felitiae0619HT和H.megidis0627M的生殖力无显著影响，S.felitiae0619HT经低湿胁迫后，随胁迫时间的增加，生殖力有升高趋势(表1)。

表1 低湿胁迫处理下昆虫病原线虫的生殖力

3 讨论

EPN作为一种活体生物，对其基本生物学特性产生最显著的影响是非生物胁迫(逆境)。试验表明，昆虫病原线虫在逆境胁迫条件下，其存活率、致病力、侵入率和生殖力等会发生改变[8,10]，而且线虫的不同种类、同种类的不同品系、同品系的不同阶段，其抵抗非生物胁迫的能力也有所不同[12]。抗逆性幼虫(侵染期线虫)daner juvenile，是昆虫病原线虫(EPN)的生活史中，抵御和适应逆境胁迫的最佳阶段。逆境胁迫对抗逆性幼虫的影响及塑造，及抗逆性幼虫对逆境胁迫的适应能力及反应，直接决定了IJs能否通过逆境胁迫存活。结果表明，低湿胁迫对线虫存活有影响，但在一定的相对湿度和低湿胁迫时长内，大部分供试的斯氏属线虫能存活并完成生活史，说明甘肃省昆虫病原线虫对低湿胁迫有一定的适应性和抗逆性。

EPN对逆境胁迫的耐受程度首先取决于它的遗传特性，因此不同的线虫在相同的胁迫因子的影响下有不同的耐受力；其次，同种线虫在对不同栖境的长时间适应下，其抗逆性也会改变以适应生境。研究结果表明，不同EPN经低湿胁迫处理后，其致病力会相应的发生不同程度的变化，与以往研究结果相似。

Shapiro等[9]的研究结果表明，在低湿胁迫下(50%)，EPN在90 min 内会死亡。试验所筛选出的S.kraussei0657L经低湿胁迫处理9 h后，其存活率为为80.3%。陈松笔等[18]的研究报道，低湿胁迫9 h 后S.carpocapsaeCB-16 品系具有较高的抗低湿胁迫能力，存活率为85.3 %[18]。均说明昆虫病原线虫的抗低湿胁迫能力在不同种类和分布区域之间存在差异。试验表明，供试的8 种EPN中，5种斯氏属线虫和1种异小杆属线虫经低湿胁迫处理5 h 后存活率均在74%，说明甘肃省本土分类获得的昆虫病原线虫，经过试验，在供试的8种昆虫病原虫中，有5种斯氏线虫和1种异小杆属线虫通过低湿条件处理5 h ，仍有74%存活率，证明其对低湿胁迫的抗逆性较强。通过这一生物习性的发现，可以将昆虫病原线虫的应用范围向干旱地区扩展，并提高其对叶面害虫的控制效能。

昆虫病原线虫领域研究的热点，一直是低湿胁迫对昆虫病原线虫的影响及其抗低湿胁迫能力和适应力，有报道昆虫病原线虫对叶部害虫防治效果的主要限制因子是低湿胁迫[19-20]。但是，结合此次试验结果，在一定的胁迫时长内，低湿胁迫对昆虫病原线虫的致病力无显著影响，因此，是否是UVB影响昆虫病原线虫迁移能力[21]，使其不能接近和侵染靶标昆虫，进而使线虫对叶部害虫防治效果降低，还是因为叶面干燥影响其对靶标昆虫的致病力，还需进一步研究。

4 结论

甘肃省分离得到的昆虫病原线虫在低温胁迫方面有较好的抗逆适应能力，异小杆线虫抗低湿胁迫能力较斯氏属线虫弱，其中S.kraussei0657L抗低湿胁迫能力最强；低湿胁迫能使昆虫病原线虫的侵入率降低，但是对其致病力无显著影响；且低湿胁迫对斯氏属S.felitiae0619HT和异小杆属H.megidis0627M的生殖力无显著影响。