余鹏飞 宋 红

浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

支气管哮喘（以下简称哮喘）已经成为当今世界上最为普遍的疾病之一，是由多种细胞(嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。中医学根据辨证论治将哮喘分成热哮、冷哮、虚哮3个证型。从证候角度，每一个中医证候是由许多因素组成的复杂性表型，使用单一的生理、生化指标来表达描述证候本质，阐释生理病理机制及疾病治疗前后的变化存在局限性和片面性。近几年迅速发展的系统生物学，以“解析生命过程的复杂性，利用整体性、系统性研究手段发现揭示生命活动本质规律”为目标[2]，其中的代谢组学通过生化表达的终端性信息，最具备反映和解决证候问题的“组”“群”“谱”集成分析功能。

在哮喘的治疗上，镇喘保肺汤为本课题基于辨证论治用于治疗肾气虚证哮喘的经验用方，以此方为媒介，利用代谢组学方法研究中药治疗哮喘的多靶点作用机制，从而揭示系统内部各组成成分及它们的相互作用和运行规律。在本次临床试验中，12例哮喘患者服药前后和8名健康对照的尿液样本通过液质联用分析，以评估与哮喘有关的终端信息，从而可能揭示哮喘的病理机制和肾气虚证哮喘的证本质。

1 临床资料

中医诊断参照《中医病证诊断疗效标准》中有关“虚哮”进行诊断。纳入标准：①发作时喉中哮鸣有声，呼吸困难，甚则张口抬肩，不能平卧，或者口唇指甲紫钳；②呈反复发作性，常因气候突变、饮食不当、情志失调、劳累等因素诱发，发作前多有鼻痒、喷嚏、咳嗽、胸闷等先兆；③有过敏史或家族史；④两肺可闻及哮鸣音，或伴有湿罗音；⑤血嗜酸性粒细胞可增高；⑥痰液涂片检查可见嗜酸细胞；⑦胸部X线检查一般无特殊改变，久病可见肺气肿征象；⑧年龄范围在40～80岁之间，男女性别不限。

2 研究方法

2.1 试验分组：对照组（A组）8例，肾气虚证哮喘组治疗前(B组）12例、肾气虚证哮喘治疗后(C组)12例。

2.2 治疗方法：对照组不予以任何干预，纳入标准的病人予以镇喘保肺汤中药汤剂口服治疗，其组成为：人参、附子、五加皮各15g，三七12g，何首乌10g，沉香（研末）、冬虫夏草各1g，蛤蚧（研末）1.5g。煎服，每日1剂，分早、晚2次服。共治疗1月。

2.3 疗效评定：治愈：哮喘控制，哮鸣音消失；好转：哮喘缓解，或发作次数减少；未愈：症状无变化。

2.4 样品的采集和处理：实验前2h取出患者尿液样品，室温下解冻摇匀，取1.0ml尿液样品于离心管中，12000r/min离心10min；取上清液200μl于2ml离心管中，加入150个单位的尿素酶，振荡30s，在37℃，反应1.5h去除尿素；加入1.7ml甲醇、0.2mg/ml的十七酸60μl和0.2mg/ml的2-氯苯丙氨酸60μl，振荡5min；10000r/min离心10min；取1.5ml上清液于玻璃管中，

50℃真空离心浓缩至干。加入60μl的甲氧胺，封盖，振荡30s，在37℃条件下反应2h启盖；加入60μl三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS)，封盖，振荡30s；在37℃条件下反应90min，振荡30s,即可。

2.5 数据处理：液质联用技术检测后，得到经质谱分析仪器自带软件导出原始数据（质荷比对应的峰强度）Excel文件，对数据进行归一化处理，使用SMICA-P软件进行分析，对该数据矩阵进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)建模分析。根据OPLS-DA模型的 VIP（Variable Importance in the Projection）值，并结合t-test的P值来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库（Metlin）（比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量Mass）并通过检索在线数据库（KEGG、HMDB、LIPID、Metlin）定性可能的差异性代谢物。然后，对差异性代谢物进行代谢通路分析。

3 结果

3.1 PCA分析：试验结束后统计，C组最后采集的样本量为8例；A组为8例，B组为12例。从图1中可以看出，A组与B组相比较，B组的代谢组已经偏离了正常状态，两组间具有显著差异；B组与C组相比较，也具有差异。

图1 A组与B组、B组与C组的PCA得分图（ESI+）

图2 A组与B组、B组与C组的OPLS-DA得分图（ESI+）

表1 正模式下B-C两组的差异性代谢物

3.2 OPLS-DA分析：在寻找代谢差异物的过程中，为了将样本与研究目的不相关的非诱导性生物学差异及样本处理及分析过程中的技术性偏差的变异区别开来，我们进一步应用OPLS-DA分析，A组和B组在正模式下得到1个主成分和3个正交成分，R2X=0.528，R2Y=0.998，Q2=0.83；B组和C组在正模式下得到1个主成分 和 5个 正 交成分 ，R2X=0.808，R2Y=0.999，Q2=0.989。模型的参数R2Y表示模型的解释率，Q2表示模型的预测率。其得分图如图2所示：其中用于判别模型质量好坏的R2Y和Q2值均大于0.4，表示模型可靠。从图中也可看出，在第一预测的主成分（t[1]）方向上具有很好的区分聚类趋势，该模型只有一个预测主成分能够代表肾气虚证哮喘所造成的人体尿液代谢组的改变。

3.3 组间差异性代谢产物的挖掘及鉴定：采用OPLS-DA模型的VIP值（阈值＞1），并结合t-test的P值（P＜0.05）来寻找差异性代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库（Metlin）（比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量Mass）。数据见表1、表2。

表2 正模式下A-B两组的差异性代谢物

数据显示，与正常组相比，哮喘患者的尿液中L-缬 氨酸、L-酪氨酸、吲哚乳酸、胆碱、3-吲哚乙酸、己酸、四氢可的松、十六烷二酸、4-吡哆酸、醋酸等物质明显增加，溶血磷脂酰乙醇胺、L-脯氨酸、孕烯醇酮、雄酮、辛酸、烟酰甘氨酸、二十碳五烯酸、雄甾酮葡萄糖醛酸苷、氢化肉桂酸、睾酮葡萄糖醛酸苷、癸二酸、烟酸等物质明显减少。服用镇喘保肺汤后，哮喘患者与用药前相比尿液中N-异戊酰甘氨酸、麦芽糖、甲基丙二酸、腺苷、前列腺素E2、异丁酸等物质明显增加；1-甲基组氨酸、水杨酸、3-甲基硫代丙酸、牛磺酸、L-酪氨酸、4-吡哆酸、2-羟基己二酸、肌酸、N1-乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、N6，N6，N6-三甲基-L-赖氨酸明显减少。L-酪氨酸和4-吡哆酸在哮喘患者身上高于正常组，服药后降低。

我们将上述差异代谢物的名称进行通路归属，并在线分析（MetaboAnalyst），并结合P＜0.05，FDR≠1，A组与B组的数据在类固醇激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis）的通路上匹配到4/99。由于在线数据库的局限性，B组与C组的数据没有符合要求，但其差异代谢物的通路可能主要涉及氨基酸代谢、维生素B6的代谢、氮代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、硫胺素代谢等。

4 讨论

酪氨酸是一种非必需氨基酸，是机体多种生成物的原料，酪氨酸在体内可通过不同代谢途径转化为多种生理物质，如多巴胺、肾上腺素、甲状腺素、黑色素及罂粟(鸦片)的罂粟碱。这些物质与神经传导和代谢调节控制关系密切。而酪氨酸激酶抑制剂可能影响气道炎症和重塑，作为治疗哮喘的新药也正在动物模型和早期临床试验中进行测试[4]。这提示酪氨酸或其合成的上游物质减少，可能与治疗哮喘的作用机制有关。另外，Fogarty A[5]等在临床病例对照中发现而精氨酸、苯丙氨酸和色氨酸可能对哮喘有不良影响。而在苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成通路中（图3），苯丙氨酸在苯丙氨酸羟化酶的作用下转变成酪氨酸，从而酪氨酸增加，这与我们在哮喘患者中检测到的酪氨酸增加，服药后降低的变化结果吻合。因而镇喘保肺汤很可能是通过抑制酪氨酸的合成从而控制哮喘的发作。

图3 苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成通路（部分）

在肝脏中，吡哆醛在醛氧化酶作用下不可逆地转化为4-吡哆酸，4-吡哆酸也是维生素B6的最终排泄产物[6-7]。最新研究结果表明，循环的吡哆醛-5'-磷酸（PLP）与肺癌风险有关。PAr指数定义为4-吡哆酸/（吡哆醛+PLP）的比率，反映了炎症期间维生素B6分解代谢增加。PAr已被定义为前瞻性队列研究中肺癌风险的标志[8]。患者服用镇喘保肺汤之后4-吡哆酸的降低提示该方使炎症得到了控制，维生素B6的分解代谢降低。但是这一结论只是侧面应证了镇喘保肺汤控制肺部炎症的疗效指标，提示了该方对肝脏代谢的影响显著，仍然不足以阐明镇喘保肺汤的作用机制。

通过上述研究结果的分析，笔者认为，在下一步对镇喘保肺汤作用机制的研究工作中，重视其在肝脏代谢中的相关作用机制，有可能是我们阐明作用机制的关键所在。

5 参考文献

[1]Johnston S L,Pattemore P K,Sanderson G,et al.Community study of role of viral infections in exacerbations of asthma in 9-11 year old children[J].Bmj,1995,310(6989)：1225-1229.

[2]李健杰,高钰琪.生物医学整合系统化研究与发展[J].世界科技研究与发展,2017,39(6)：491-496.

[3]傅淑艳,徐志瑛.支气管哮喘治法探讨[J].浙江中医杂志,2000,35(8)：38.

[4]OlinJT,WechslerME.Asthma：Pathogenesisand novel drugs for treatment[J].Bmj,2014,349：g5517.

[5]Fogarty A,Broadfield E,Lewis S,et al.Amino acids andasthma：Acase-controlstudy[J].Eur Respir J,2004,23(4)：565-568.

[6]Galluzzi L,Vacchelli E,Michels J,et al.Effects of vitamin b6 metabolism on oncogenesis,tumor progression and therapeutic responses[J].Oncogene,2013,32(42)：4995-5004.

[7]Ueland P M,Ulvik A,Rios-Avila L,et al.Direct and functional biomarkers of vitamin b6 status[J].Annu Rev Nutr,2015（35）：33-70.

[8]Zuo H,Ueland P M,Midttun O,et al.Results from the european prospective investigation into cancer and nutrition link vitamin b6 catabolism and lung cancer risk[J].Cancer Res,2018,78(1)：302-308.