,*

(1.西京学院医学院,陕西西安 710000; 2.昆明理工大学生命科学与技术学院,云南昆明 650500)

乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞外的一种糖类化合物[1],是乳酸菌在长进化过程中适应环境的产物,不仅可以保护菌体而且因其具有调节皮肤免疫力、抗肿瘤、抗炎以及免疫调节等作用,在诸如化妆品、制药、食品等生物技术方面得以应用[2-6]。

本研究从四川传统发酵泡菜中分离得到的三株高产胞外多糖的副干酪乳杆菌的发酵培养液中提取其生物合成的胞外多糖,对其体内外抗氧化特性进行研究,以期为扩大乳酸菌的综合利用,以及乳酸菌胞外多糖在食品体系中作为一种具有抗氧化性质的新型添加剂提供理论基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

副干酪乳杆菌3号、5号和7号三株菌株 均来源于昆明理工大学生命科学与技术学院应用微生物组从四川传统发酵泡菜中分离获得,并在-80 ℃下含20%甘油的MRS培养基中储存;蛋白胨、牛肉膏、酵母粉 OXOID LTD.;葡萄糖、无水乙醇 西陇化工股份有限公司;三水合磷酸氢二钾 广东光华科技股份有限公司;乙酸钠、七水硫酸镁、四水硫酸锰、柠檬酸钾、碳酸氢钠、苯酚、抗坏血酸、过氧化氢、硫酸亚铁 天津市风船化学试剂科技有限公司;Tween-80、DPPH自由基、亮绿、邻苯三酚 Solarbio公司;三氯乙酸 天津市光复精细化工研究所;乙二胺四乙酸 生工生物工程(上海)有限公司;硫酸 重庆川东化工(集团)有限公司;杜尔伯科极限必需培养基(DMEM) 德国Invitrogen公司;MDA、SOD、T-AOC测定试剂盒 上海世锋生物科技有限公司。

SI-234天平 德国Denver Instrument公司;Autoclave SX-500灭菌锅 TOMY公司;GRX-9123A烘箱 上海齐欣科学仪器有限公司;SW-CJ-1FD超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;GL-3250A磁力搅拌器 AS ONE公司;GHP-9160培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;YC-300L冰箱 中科美菱低温科技有限责任公司;3-18K124178离心机 SIGMA公司;透析袋(1000) 美国联合碳化公司;FD5-12真空冷冻干燥机 SIM公司;Biochrom Ultrospec 2100 pro UV分光光度计 美国柏楉有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 MRS培养基:蛋白胨10 g/L,牛肉膏8 g/L,酵母粉4 g/L,葡萄糖20 g/L,三水合磷酸二氢钾2 g/L,乙酸钠5 g/L,七水硫酸镁0.2 g/L,四水硫酸锰0.05 g/L,柠檬酸三铵2 g/L,Tween 80 1 mL/L。

MRS改良培养基[17]:葡萄糖20 g/L,酵母粉30 g/L,三水合磷酸二氢钾2 g/L,乙酸钠5 g/L,七水硫酸镁0.2 g/L,四水硫酸锰0.05 g/L,柠檬酸三铵2 g/L,Tween 80 1 mL/L。

1.2.2 菌株的活化与培养 将三株副干酪乳杆菌从-80 ℃取出后按体积分数2%的接种量接种至含有5 mL MRS基本培养基的试管中培养12 h。传代培养2次后再按体积分数2%的接种量转接至新鲜的含有500 mL MRS改良培养基的锥形瓶中37 ℃培养24 h。

1.2.3 胞外多糖分离纯化 将细菌培养液于4 ℃、10000×g离心15 min,除去细胞,在上清中加三氯乙酸(TCA)至质量分数为4%,并在室温下震荡摇匀,静置30 min,10000×g离心15 min去除沉淀蛋白;离心后的上清中加三倍体积的预冷无水乙醇沉淀,-20 ℃过夜;4 ℃、12000×g离心30 min收集沉淀;将沉淀用ddH2O溶解,转移到经过前处理(将透析袋根据自己的需要剪成适当的长度,一般为10～20 cm的小段;在大体积的质量体积比为2%碳酸氢钠和1 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA,pH8)的溶液中,将透析袋煮沸10 min;用蒸馏水彻底清洗透析袋;再用1 mmol/L的EDTA(pH8)溶液将透析袋煮沸10 min;冷却后存放于4 ℃冰箱中)的透析袋中透析2 d,期间每8 h换水一次;收集透析液后真空冷冻干燥[18]。

1.2.4 总糖量测定 将冷冻干燥后的三株副干酪乳杆菌胞外多糖用ddH2O溶解,利用苯酚-硫酸法[19]测定胞外多糖产量。以葡萄糖为标准品制作标准曲线,得到回归方程:y=14.929x+0.007,R2=0.9996,曲线拟合良好,并通过回归方程计算副干酪乳杆菌的胞外多糖产量。

1.2.5 胞外多糖体外抗氧化活性测定 称取冷冻干燥的胞外多糖样品,配制为400 μg/mL的母液,再用ddH2O稀释为浓度梯度100、200、300、400 μg/mL备用。同时以相同浓度的抗坏血酸作为阳性对照。

1.2.5.1 DPPH·的清除率 副干酪乳杆菌胞外多糖清除DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)的测定参考Hromádková等[20]的方法并稍加修改,在试管中加入1.0 mL样品溶液,室温下避光静置30 min,测定517 nm处的吸光值A样;同时,测定1.0 mL样品溶液与2.0 mL无水乙醇混合液在517 nm 处的吸光度A对,再测定2.0 mL DPPH·溶液与1.0 mL 70%乙醇溶液在517 nm 处的吸光值A空,每个浓度三组重复。按式(1)计算DPPH·清除率:

式(1)

1.2.5.2 ·OH的清除率 本试验参考Pan等[8]的方法对胞外多糖清除·OH的能力进行分析,并略有改进:将1.0 mL亮绿(C27H34N2O4S,0.435 mmol/L),2.0 mL FeSO4(0.5 mmol/L),1.5 mL H2O2(3.0% W/V分别加入到1 mL不同浓度干酪乳杆菌胞外多糖常溶液常温下分别混合摇匀,常温静置20 min测定波长624 nm下吸光值。按式(2)计算·OH清除率:

式(2)

式中:AS为样品的吸光度;A0为不加样品的吸光度;A为不加样品和Fenton反应体系的吸光度。

式(3)

式中:Aa为不加样品,但加入邻苯三酚的吸光度;Ab为加入样品和邻苯酚的吸光度;Ac为加入样品,但不加邻苯三酚的吸光度。

1.2.6 胞外多糖缓解293T细胞氧化损伤能力评价实验 由于副干酪乳杆菌胞外多糖在体外抗氧化活性分析中没有显著性差异,因此在研究缓解293T细胞氧化损伤能力评价实验中仅选取3号菌株作为研究对象。

1.2.6.1 293T细胞系的培养及处理 人体肠上皮细胞系293T细胞在杜尔伯科极限必需培养基及5%的CO2气体37 ℃条件下常规培养,添加10%(v/v)灭活的胎牛血清和混合抗生素,混合抗生素最终浓度分别为100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素和25 U/mL两性霉素B。将1 mL细胞悬液(密度为2×105个/mL)接种于6孔板孵育细胞附着培养。孵育培养12 h后,为评价干酪乳杆菌胞外多糖对细胞过氧化氢损伤的保护作用,每个孔添加2 mL含终浓度为100 μmol/L的H2O2,终浓度为100、200、300和400 μg/mL的EPS无血清培养基混合物(以不用H2O2处理为对照组,以不加胞外多糖保护组做模型组)。培养24 h后,除去培养上清,取出细胞悬浮液,在1 mL的缓冲液(50 mmol/L的Tris-HCl pH 8.0、50 mmol/L EDTANa2、0.2 mol/L NaCl、1% Triton X-100)中裂解细胞,产生细胞匀浆,10000×g,4 ℃,离心15 min,取上清。检测前上清液储存在-20 ℃。

1.2.6.2 丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力及总抗氧化能力(T-AOC)测定 使用MDA、SOD、T-AOC测定试剂盒进行测定。测定方法以及计算方式参照说明书进行。

按式(4)计算MDA含量计算公式:

式(4)

式中:A测为加入样品的吸光度;A标为加入标准品(四乙氧基丙烷)的吸光度;A空为加入空白样(无水乙醇)的吸光度;A对为用A空代替;据此可以计算出酶活性大小。

定义1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U),故按式(5)计算SOD活力计算公式为:

式(5)

式中:A测为加入样品的吸光度;A对为加入对照品(双蒸水)的吸光度。

总抗氧化能力定义为在37 ℃时,1 min 1 mL样品使反应体系的吸光度值每增加0.01时,为一个总抗氧化能力单位(U),故按式(6)计算计算总抗氧化能力:

式(6)

式中:A测为加入体系、样品,37 ℃水浴30 min的吸光度;A对为加入体系,37 ℃水浴30 min后加入样品的吸光度。

1.3 数据处理

每组实验重复3次,实验结果为3次重复的平均值,采用SPSS 22.0软件进行实验数据的统计与分析。检测水准为0.05,运用最小显著差异(Least significant difference,LSD)法比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 总糖量测定结果

本实验采用苯酚-硫酸法测定所分离的胞外多糖产量,3号、5号、7号菌株的产量分别达(205.863±4.306)、(210.775±6.331)、(233.550±4.306) mg/L。李向菲等[22]根据产量将产胞外多糖乳酸菌分为高产(产量≥180 mg/L)、中产(180>产量≥120 mg/L)和低产(产量<120 mg/L)胞外多糖菌株。本研究这三株菌株胞外多糖产量都高于180 mg/L,根据划分标准,这三株副干酪乳杆菌均为胞外多糖高产菌株。

2.2 DPPH·清除活性分析

抗坏血酸以及副干酪乳杆菌生物合成胞外多糖清除DPPH活性如图1所示。3株副干酪乳杆菌生物合成胞外多糖均具有一定清除DPPH·的能力,且对清除DPPH·的能力均表现出浓度依赖的特征,对DPPH·清除率随胞外多糖的浓度100～400 μg/mL逐渐增大,当胞外多糖浓度为400 μg/mL时,3号、5号、7号菌株胞外多糖对DPPH·清除率分别为6.55%、8.87%、8.80%(图1B),但均低于抗坏血酸对DPPH·的清除率(图1A)。Zhang等[14]对植物乳杆菌C88胞外多糖抗氧化性分析得到类似的结果,他们结果显示胞外多糖对DPPH·清除活性随其浓度增加而增加,当胞外多糖浓度达1.0 mg/mL时活性最大,进一步增加也不会显着影响活性,当浓度为4.0 mg/mL时,其胞外多糖和抗坏血酸分别显示出DPPH自由基清除活性为52.23%和88.60%;而张玉龙等[23]筛选出的8株产胞外多糖乳酸菌中,七株乳酸菌所产胞外多糖均比抗坏血酸的DPPH·清除能力强,并且其胞外多糖的DPPH·清除能力,最高可达11.93%±0.01%,是抗坏血酸的2倍。

图1 抗坏血酸以及胞外多糖对DPPH·的清除活性Fig.1 Scavenging activity of VC and extracellular polysaccharide against DPPH·

2.3 ·OH清除活性分析

在本研究中,·OH来源于Fenton反应(Fe2++H2O2=Fe3++OH-+HO·),以亮绿作为显色剂。胞外多糖对·OH的清除活性如图2所示。随着胞外多糖的浓度增加,清除率呈上升趋势,并且具有明显的剂量依赖关系。当胞外多糖浓度达400 μg/mL时,3号、5号、7号3株副干酪乳杆菌胞外多糖对自由基清除率分别为86.57%、82.59%、88.94%,均高于抗坏血酸的清除率(65.87%),这表明3株副干酪乳杆菌胞外多糖都具有强的·OH清除能力。Guo等[24]的研究结果也得到相同的结果,胞外多糖羟基自由基清除活性以浓度依赖的方式增加。另有研究表明,副干酪乳杆菌VL8所产胞外多糖在浓度于200 μg/mL时其胞外多糖的·OH清除率与抗坏血酸就已经基本持平(41%),并且随着EPS浓度的增加其羟基自由基清除率也有所增长[13]。这体现出本研究所分离的3株副干酪乳杆菌EPS在·OH清除方面是具有一定潜力。

图2 胞外多糖与VC对羟基自由基的清除活性Fig.2 Scavenging activity of extracellular polysaccharide and VC against hydroxyl radical

图3 胞外多糖与VC超氧阴离子自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of extracellular polysaccharide and VC against superoxide anion free radical

2.5 胞外多糖缓解293T细胞氧化损伤能力评价

2.5.1 丙二醛(MDA)含量 丙二醛(MDA)是自由基攻击膜不饱和脂肪酸的产物可以与蛋白质的游离氨基作用,引起蛋白质分子内和分子间交联,导致细胞损伤[25],MDA含量越高说明细胞损伤越严重。本实验的3号副干酪乳杆菌胞外多糖作用H2O2诱导的293T细胞的MDA含量的结果如图4所示。将对照组293T细胞内MDA水平与模型组293T细胞(内MDA水平进行比较,在胞外多糖浓度100～400 μg/mL时,MDA的水平均有显著的降低(P<0.05)。随着胞外多糖浓度的升高,MDA水平呈逐步降低的趋势,高浓度(400 μg/mL)胞外多糖处理导致MDA水平最低。MDA水平的逐渐降低,表明胞外多糖在一定程度上抑制了膜脂质过氧化,保护了细胞的脂质膜,阻断了外界活性氧的侵入。有研究显示植物乳杆菌的胞外多糖能够抑制Caco-2细胞内MDA的形成,用胞外多糖处理后的胞内MDA水平显著降低(P<0.05),并且具有剂量效应[14],这与本研究结果一致。

图4 293T细胞MDA含量Fig.4 MDA content in 293T cells注:小写字母不同代表差异显著(P<0.05);图5、图6同。

2.5.2 超氧化物歧化酶(SOD)活力 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是一种源于生命体的活性物质,能专一地清除体内有害的自由基,以解除自由基氧化体内的某些组成成分而造成的机体损害,其活性的高低可间接反映组织中超氧自由基的含量和细胞受损程度[21]。胞外多糖作用于H2O2诱导的293T损伤细胞的SOD活性的结果如图5所示。与对照组相比模型组SOD活性显著降低,经过胞外多糖处理后SOD活性有所增加,并且随着胞外多糖浓度的升高SOD活性逐步增大。同类研究中,Zhang[14]等在对植物乳杆菌C88胞外多糖抗氧化性的进一步研究显示,将胞外多糖预处理24 h即可以恢复H2O2处理的Caco-2细胞的SOD活性,与氧化损伤模型细胞相比,高剂量的胞外多糖(100和200 μg/mL)能显着提高SOD水平。白丽娟[26]利用瑞士乳杆菌SMN2-1的主要多糖组分EPS-S1处理D-半乳糖亚急性衰老小鼠模型,也发现当胞外多糖为100及200 mg/kg时能够极显著恢复肝脏以及脑组织中SOD活性(P<0.01)。这也表明了乳酸菌胞外多糖在抗氧化方面所具有的潜力。本实验所用的胞外多糖能够清除H2O2造成的自由基从而恢复SOD活性。

图5 293T细胞SOD活性Fig.5 SOD activity in 293T cells

2.5.3 总抗氧化(T-AOC)能力 如图6所示,将293T细胞用H2O2诱导损伤后,细胞的总抗氧化能力显著降低(P<0.05),当用胞外多糖的处理之后,使得损伤细胞的总抗氧化能力得以逐步恢复,这表明胞外多糖对能够缓解细胞的氧化损伤。在胞外多糖浓度为100、200、300和400 μg/mL时,对照组、模型组以及各多糖处理组的总抗氧化活性分别是1.480、0.575、1.069、1.480、1.932和2.056 U/mL。经过不同浓度的EPS孵育后T-AOC水平显著提高(P<0.05)。从总抗氧化水平来看,高浓度(≥300 μg/mL)的EPS可以提高细胞的总抗氧化能力,陈佩等[27]研究了干酪乳杆菌对HepG2细胞抗氧化功能的影响,结果谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活力分别提高了80%、30%和124%(P<0.05)。

图6 293T细胞总抗氧化能力(T-AOC)Fig.6 Total antioxidant capacity(T-AOC)in 293T cells

总之,根据本研究中各氧化指标的检测结果,我们认为可能是由于胞外多糖清除了部分自由基,并且能够对细胞内的抗氧化系统起到辅助甚至促进的作用,保证其正常的运行,抵御H2O2对细胞的氧化损伤,使细胞得以修复。

3 结论

作为一种天然的抗氧化物质,乳酸菌胞外多糖具有巨大的开发潜力,本研究所探讨的3株副干酪乳杆菌生物合成的胞外多糖在体内外均有一定的抗氧化能力。体外实验中发现,胞外多糖对羟基自由基清除能力较好。而细胞实验中发现,副干酪乳杆菌产胞外多糖作用于H2O2诱导氧化损伤的293T细胞,能够显著的提高SOD活性、总抗氧化能力并抑制丙二醛(MDA)的生成(P<0.05)。总之,这3株株副干酪乳杆菌胞外多糖具有良好的抗氧化性,作为食品添加剂有较好的运用潜力,如何增强其抗氧化性能将是之后的研究方向。