田景，金华，申国安*，郭宝林*，姜志海，李砾，杨相波

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193； 2.国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，贵州 贵阳 550009

拟巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo为小檗科淫羊藿属多年生草本植物，是国内首个实现栽培化的淫羊藿属药用植物品种，其化学成分构成以朝藿定C含量高为特点(1.5%以上)，优于巫山淫羊藿，本课题组一直致力于开展淫羊藿的种植技术研究和规范化栽培，制定了拟巫山淫羊藿的种子质量标准[1]，并调查了其生长的土壤条件[2]。植物生长调节剂在药用植物栽培生产中用于促进生根，提高成活率等已有较多研究[3-6]，本文则进行了植物生长调节剂促进拟巫山淫羊藿芽数目进而改善其栽培状况的研究。

拟巫山淫羊藿和大多数淫羊藿属植物一样，是地面芽植物，地上部分的花茎和基生叶从根芽萌发生长，而根芽是在上一年度秋冬季形成。淫羊藿的药用部位是叶片，因此通过促进冬季根芽形成可以提高第二年产量。

本课题组此前的研究发现6-BA及6-BA与尿素的综合处理具有显著的促进拟巫山淫羊藿采收后再萌发的作用[7]，考虑到促进冬芽形成和促进采收后再萌发的作用对象都是腋芽，作用原理都是主要通过打破顶端优势以促进腋芽膨大生长或萌发成枝，具有一致性。因此本论文继续研究了6-BA及尿素对秋冬根芽形成的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料选用二年生拟巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo实生苗，由中国医学科学院药用植物研究所郭宝林研究员鉴定。

1.2 仪器与试剂

仪器：珀金埃尔默HPLC仪器(Flexar PDA LC Detector，Totalchrom色谱工作站)，KQ-500DE 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，十万分之一电子天平(瑞士MettlerToledo公司)，万分之一天平(上海精密科学仪器有限公司)，0.22 μm微孔滤膜(上海新亚净化器件厂)。

试剂：无水乙醇(AR，北京化工厂)，乙腈(HPLC，Fisher)，娃哈哈纯净水，盐酸(AR，北京化工厂)。尿素(AR，99%)，6-BA(AR，99%)，均购自上海源叶生物科技有限公司。对照品朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C及淫羊藿苷均为实验室自制，纯度大于99%。

1.3 实验设计

喷叶处理方式及灌根处理方式各一次实验，均采用随机区组设计。

喷叶处理实验：于2016—2017年在贵州省雷山县拟巫山淫羊藿栽培实验地(N 26°21′，E 108°1′，海拔1300 m)进行。土壤全氮3.48 g·kg-1，有机质48.7 g·kg-1，碱解氮222 mg·kg-1，有效磷63.1 mg·kg-1，速效钾84.2 mg·kg-1，pH 4.40。设三个区组，6个处理，每个处理3个重复(详见表1)，每处理面积3×1.2 m，约60株。于2016年11月25日下午及12月1日下午共施药两次，每次每个处理叶面喷施1 L。实验期间定期除草并预防和控制病虫害。

灌根处理实验：于2017—2018年在贵州省雷山县拟巫山淫羊藿栽培试验地(N 26°21′，E 108°5′，海拔1250 m)进行，试验地土壤全氮2.51 g·kg-1，有机质66.1 g·kg-1，碱解氮313 mg·kg-1，有效磷68.7 mg·kg-1，速效钾130 mg·kg-1，pH 4.72。设3个区组，8个处理，每个处理3个重复(详见表1)，每处理每区20株。2017年11月14、15日连续两天施药，每次每株灌根50 mL，将液体装入自封袋，剪小口直接施到植株根部及附近的土壤上。实验期间定期除草并预防和控制病虫害。

表1 促进拟巫山淫羊藿根芽形成实验设计

1.4 秋冬芽和萌发生长量统计

喷叶处理实验：在2016年11月24日，每处理标记其中长势中等和均匀的13株。2017年，在上一年度首批根芽萌发且叶片成熟后的6月13日和14日，按株采收标记植物的全部地上部分，带回，晾干，然后统计每株的新地上部分重量(2017年新萌发部分)，老地上部分重量(2016年生长的地上部分，一般老叶留存到在2017年6月下旬才开始逐步死亡)。

灌根处理实验：2018年，在当年秋冬季根芽形成结束并即将开始萌发的2月6日和8日，每个处理取10株，将整株挖取，洗去泥土，记录每株芽的数目(包括一级芽、二级芽)，记算总芽数(总芽数=二级芽+一级芽)(芽长>6 mm)。因2018年早春倒春寒，多数最早萌发的幼嫩地上部分被冻死，实验设计的剩余10株的萌发生长量无法准确统计。

1.5 淫羊藿苷类成分含量测定

喷叶处理实验：2016年12月22日每处理每株1片，取20株，及2017年6月13日取当年萌发的成熟叶片20片，混合用于淫羊藿苷类成分含量测定。

灌根处理实验：于2018年4月30日每处理取当年萌发的成熟叶片，每株2片，混合用于淫羊藿苷类成分含量测定。

淫羊藿苷类成分含量测定：叶片阴干，干燥叶片中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷含量的测定方法参考文献[8]。

1.6 数据分析

采用SPSS 22.0进行数据处理和统计分析，Excel 2010作表及作图。

2 结果与讨论

2.1 灌根处理对芽数目的影响

拟巫山淫羊藿形成于根状茎节上的芽为腋芽，外面鳞片包被。根据芽的着生位置不同，将直接从老根状茎(一般是上一年度形成)上产生的芽定义为一级芽，一级芽随后不断生长，随后此芽饱满，生长、伸长变粗为新的根状茎，根状茎节上又有腋芽形成和膨大生长，形成的新芽称之为二级芽。一级芽和二级芽中长度大于6 mm的芽一般会在第二年早春萌发，形成当年的地上部分，4月末到6月初成熟，药材产量也主要据此而计算，而小于6 mm的芽则多数不在早春萌发，因此本文仅计数大于6 mm的一级芽和二级芽。

由表2可以看出仅300 mg·L-1尿素和60 mg·L-16-BA的综合处理显著增加了总芽数目，较对照组增加44.08%(P<0.05)，表现为二级芽数目显著较高，较对照组增加60.97%(P<0.05)。

30 mg·L-1的6-BA处理显著降低了二级芽数目，但一级芽的数目较对照组显著增加，较对组提高59.70%(P<0.05)，总芽数与对照组相比差异无统计学意义。

不同浓度的尿素处理(Urea 300 mg·L-1、Urea 500 mg·L-1、1000 mg·L-1)对芽形成无显著影响。

2.2 叶面喷施处理对产量的影响

2.2.1对处理后第二年薪萌发地上部分重量的影响 本次试验因故未能统计秋冬季的芽形成数目，但拟巫山淫羊藿在秋冬季形成的芽的数目越多，第二年新形成的植株地上部分产量就越多，因此也可以通过评价第二年新萌发地上部分重量来评价不同处理对冬芽形成的影响。

表2 不同处理对拟巫山淫羊藿中平均每株芽数目的影响

注：同列标相同字母表示处理之间差异无统计学意义，标不同字母表示处理之间差异具有统计学意义，P<0.05。

从图1可以看出6-BA 60 mg·L-1的处理组新萌发地上部分重量显著高于其他组，与清水对照组相比，重量增加22.76%(P<0.05)；60 mg·L-1的6-BA与300 m·L-1的尿素综合处理组与对照组相比差异无统计学意义，但比60 mg·L-1的6-BA处理组的重量少21.82%(P<0.05)。

注：不同字母表示两处理之间差异具有统计学意义(P<0.05)，相同字母表示两处理之间差异无统计学意义。图1 不同处理对拟巫山淫羊藿产量的影响

2.2.2 对老地上部分重量的影响 老地上部分为第二年6月初采收的植株中的上一年形成的部分。

实验发现6-BA 60 mg·L-1的老地上部分重量最高，较清水对照组增加38.49%。增加尿素的综合处理(U 300 mg·L-1+6-BA 60 mg·L-1)与对照组相比差异无统计学意义，但是比6-BA 60 mg·L-1处理组重量显著降低18.1%(P<0.05)。

2.3 不同处理对淫羊藿苷类成分含量的影响

拟巫山淫羊藿中朝藿定C的含量占总淫羊藿苷类含量(四种淫羊藿苷类成分含量之和)的85%以上，因此本文总的淫羊藿苷类含量与朝藿定C含量变化一致。

从表3可以看出，在灌根处理实验中，各处理因素对新萌发的成熟叶片中朝藿定C和总的淫羊藿苷类黄酮成分的量无显著影响。喷叶处理促进根芽形成实验中，各处理组对老叶成熟叶片中朝藿定C的含量与对照组相比均差异无统计学意义，仅6-BA 90 mg·L-1处理组总淫羊藿苷类黄酮成分含量低于对照组，较对照组低6.8%(P<0.05)；各处理组对第二年新生成熟叶片中朝藿定C及总淫羊藿苷的含量与对照组相比均差异无统计学意义，仅6-BA 60 mg·L-1处理组朝藿定A、朝藿定B及淫羊藿苷的含量相对较低。

表3 不同处理对拟巫山淫羊藿中淫羊藿苷类黄酮成分含量的影响

注：同列标相同字母表示处理之间差异无统计学意义，标不同字母表示处理之间差异具有统计学意义，P<0.05。

3 拟巫山淫羊藿根芽发育及影响因素

在根芽形成初期(从8月开始)，主要形成较多的一级芽，在芽形成中后期，在一级芽的基础上，才形成较多的二级芽，也继续有一级芽形成。11月中旬为芽形成的中后期。灌根促进根芽形成实验发现300 mg·L-1的尿素和60 mg·L-1的6-BA的综合处理显著促进二级芽数目进而提高总芽数目，前期实验发现该综合处理同样也是喷根处理促进采收后再萌发的最适合处理[7]，进一步验证了两者作用的一致性，可能都是主要通过打破顶端优势促进腋芽膨大或萌发，但是具体机制有待进一步深入实验探讨。单独的6-BA或尿素处理均没有表现出显著促进根芽数目的效果。其他研究也发现氮素和6-BA配合使用显著提高了小麦分蘖节ZT含量，降低了内源ABA、GA3含量，进而显著增加小麦分蘖发生率，显著提高了分蘖芽长度、鲜重[9]。

6-BA 60 mg·L-1的喷叶处理组淫羊藿的次年新萌发地上部分重量显著高于其他组，该处理组老地上部分重量也显著较对照组高，说明通过叶面喷施6-BA提高产量可能是6-BA处理增加光合速率，延缓衰老，使当年积累营养物质较多，进而增加冬芽数目提高第二年产量。研究发现6-BA可能通过增加光合速率、抑制叶绿素降解，抑制氧自由基对植物的侵害及膜脂过氧化程度的加深，使叶片保持较高的抗氧化酶活性，从而延缓叶片衰老，例如300 mg·L-1的6-BA处理延缓牡丹叶片衰老[10]；12 g·L-1硝酸钾和10 mg·g-16-BA 综合处理可明显改善假俭草Eremochloaophiuroides(Munro)Hack.的生长，抑制其叶绿素的分解[11]；氨基酸硒和6-BA处理可有效延缓葡萄叶片衰老[12]；5 mg·L-16-BA的保鲜剂能有效延长月季切花的瓶插寿命[13]；适宜浓度的6-BA处理能够提高厚皮甜瓜坐果节位叶片光能利用效率[14]。 此外6-BA处理可显著降低采后西兰花的总呼吸强度，延缓西兰花褪绿黄化[15]，延缓玉米根系的衰老及延缓叶片衰老，使成熟期绿叶面积增加，显著增加吐丝期-成熟期植株吸氮量和植株干物质积累量，显著提高单株子粒产量[16]。同样浓度的6-BA浓度和300 mg·L-1尿素综合处理时，产量的提高并不显著，说明通过叶面喷施处理时，尿素的存在反而削弱了6-BA的促进作用。

实验发现通过喷叶处理单独的6-BA 60 mg·L-1处理即可以增加老叶重量，进而促进新芽形成和萌发增加产量，而通过灌根处理时，6-BA 60 mg·L-1和尿素300 mg·L-1综合处理更有利于芽数目的增多，说明叶片与根系对6-BA和尿素的吸收利用存在一定差异，尿素是有机态氮肥，经过土壤中的脲酶作用，水解成碳酸铵或碳酸氢铵后，才能被作物吸收利用，叶片对尿素的吸收利用低于根系，氮素和6-BA只有在根系施用时才会发挥互作效应。但是喷叶和灌根促进芽形成进而提高产量的机理和效果有何不同及是否可以同时进行灌根和喷叶处理还有待进一步研究。

此外实验发现叶面喷洒30 mg·L-16-BA或与300 mg·L-1尿素混合喷施，或90 mg·L-16-BA叶面喷施均能显著提高植株的花枝数比例，这在采种田上可用来促进开花结果。其他研究发现1 500 mg·L-1的6-BA可以显著促进花芽的分化，而浓度为500 mg·L-1时有抑制花芽分化的作用[17]，一定浓度6-BA 处理可以显著提高富士苹果幼树短枝顶芽成花率[18]。

4 结论

300 mg·L-1的尿素和60 mg·L-1的6-BA的综合处理灌根或6-BA 60 mg·L-1喷叶处理可显著促进拟巫山淫羊藿根芽形成，且对成熟叶片中的朝藿定C和总淫羊藿苷类成分不产生显著影响。