鲁静，牛晓静，段晓颖*

1.河南中医药大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450000；2.中药临床评价技术河南省工程实验室，河南 郑州 450000

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim.、箭叶淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鲜淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥叶，味辛、甘，性温，归肝、肾经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用，用于肾阳虚衰、阳痿遗精、筋骨痿软等[1]。淫羊藿多糖为淫羊藿中有效活性成分之一，具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、调节免疫、抗病毒等功能[2-6]。

目前，已有多种方法可以分离提纯淫羊藿多糖，包括煎煮法、浸提法、超声法、微波辅助提取法、酶提取法、超高压提取法等[7-12]。但煎煮法能耗较高，超声处理会影响多糖的结构和活性[13]；而酶法提取对酶促反应条件要求严格。此外，微波法、超声法和酶提取法在工业化生产中尚未广泛应用。本实验采用均匀设计法，优选淫羊藿多糖的热水浸提工艺，为其有效开发、利用提供保障。

1 仪器与试药

Thermo Evolution 201紫外可见光分光光度计(美国赛默飞世尔科技公司)；BSA224S-CW电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)；HH-S4电子恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；LXJ-IIB离心机(上海安亭科学仪器厂)。

无水葡萄糖对照品(批号：110833-200503，中国食品药品检定研究院)；蒽酮、无水乙醇、浓硫酸为分析纯。

淫羊藿药材购自河南中一医药经营有限公司，经河南中医药大学第一附属医院药学部陈天朝主任药师鉴定，符合《中华人民共和国药典》2015年版一部淫羊藿项下相关要求。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含0.107 mg的葡萄糖对照品溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取淫羊藿药材10 g，精密称定，按照设定的条件提取，过滤，取滤液适量，加入无水乙醇(4倍体积)，摇匀，4 ℃放置12 h，4000 r·min-1离心20 min，弃去上清液，沉淀用水溶解，转移并定容至100 mL，摇匀，即得。

2.3 最大吸收波长的确定

精密吸取葡萄糖对照品溶液0.2 mL，置于10 mL具塞刻度试管，加水至2 mL，摇匀，迅速精密加入0.1%蒽酮硫酸溶液6 mL，混匀，于沸水浴中加热15 min，取出，立即置冰水浴中冷却15 min，取出，以蒸馏水为空白，进行同样的显色操作，采用紫外-可见分光光度计进行扫描，扫描波长范围为400～800 nm。另取供试品溶液2 mL，同法操作。结果显示，葡萄糖对照品及淫羊藿多糖显色后均在625 nm处有最大吸收峰，见图1～2。

图1 葡萄糖对照品显色后400～800nm全波长扫描图

图2 淫羊藿多糖显色后400～800nm全波长扫描图

2.4 标准曲线的绘制

精密吸取葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，按2.3项下方法显色，在625 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线：Y=11.279X+0.020 6(r=0.999 5)，结果表明，葡萄糖在0.010 7～0.064 2 mg·mL-1与吸光度线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取供试品溶液2 mL，按2.3项下方法显色并测定吸光度，重复测定6次，记录吸光度，RSD为0.37%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液2 mL，按2.3项下方法显色，每5 min测定1次吸光度，30 min内RSD为0.72%，表明供试品溶液在30 min内稳定。

2.7 加样回收率试验

称取淫羊藿药材5 g，精密称定，共6份，分别加入葡萄糖对照品适量，按2.2项下制成供试品溶液，再按2.3项下方法显色并测定吸光度，平均回收率为99.7%，RSD为2.31%，表明方法回收率良好。

2.8 样品含量测定

精密吸取供试品溶液2 mL，按2.3项下方法显色并测定吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液中多糖含量。

2.9 均匀试验设计

多糖收率(%)=供试品溶液中多糖浓度×
供试品溶液总体积×滤液总体积/
滤液量取量/药材质量×100%

(1)

表因素水平表

表2 均匀设计试验及结果

表3 均匀设计试验对各回归系数的检验结果

对回归方程进行规划求解，得到淫羊藿多糖最佳热水浸提条件为液料比25 mL·g-1、提取温度90 ℃、提取时间140 min、提取次数3次，此时多糖收率为1.13%。

2.10 工艺验证

取淫羊藿药材100 g，共3份，按所得到的最佳提取工艺条件进行验证试验，按2.2项下制成供试品溶液，按2.8项下含量测定法进行测定，得到淫羊藿多糖收率分别为1.08%、1.09%和1.11%，与预测值接近，说明回归方程预测基本准确，优化后的实验条件可靠，结果重复性好。

3 讨论

目前对多糖的定量主要采用经典的紫外扫描方法，最常用的为硫酸-蒽酮法和苯酚-硫酸法。苯酚-硫酸法需要使用重蒸酚[14]，硫酸-蒽酮法试剂需要现配，且反应及冷却时间应严格控制[15]，本实验选用硫酸-蒽酮法测定多糖含量。

实验中考察了醇沉浓度(含醇量50%～90%)对淫羊藿多糖提取率的影响，结果发现，含醇量为80%时，多糖提取率最高，故选择醇沉浓度为含醇量80%。考察了醇沉时间(6～24 h)对多糖提取率的影响，结果发现，醇沉时间大于12 h时，多糖提取率趋于稳定，故选择醇沉时间为12 h。

均匀设计法只考虑试验点在试验范围内均匀分布，每个因素仅需用一次，与正交试验相比，大幅减少了次数，不仅节省时间，而且节约资源，适合用来优化工艺条件。本实验采用均匀设计法对热水浸提淫羊藿多糖的工艺条件进行优化，结果表明，液料比、提取温度、提取时间之间存在交互作用，验证试验得到的淫羊藿多糖的提取率与预测值相符。所建立的热水浸提工艺稳定、可行，为淫羊藿多糖进一步的研究和开发奠定了基础。