龚琴，王木兰，何鹿玲，冯育林，杨世林，杜力军，3，李俊*

1.江西中医药大学，江西 南昌 330006；2.创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室，江西 南昌 330006；3.清华大学 生命科学学院，北京 100084

白头翁Pulsatillachinensis(Bge.)Regel是临床常用中药，具有清热解毒、止痢、燥湿的作用。常用于湿热痢疾等湿热证[1]。白头翁中分离得到多种皂苷类化合物[2-4]，这类化合物具有抗炎、抑瘤等作用[5-13]。白头翁皂苷B4(简称B4)为白头翁皂苷中主要单体成分之一，属五环三萜皂苷类化合物，结构母核为23-羟基白桦酸。国内外对于B4的药理研究报道甚少，仅见少量关于抗肝癌、抗炎作用的体外细胞实验研究，以及B4在溃疡性结肠炎大鼠体内药代动力学相关实验研究，对于急性肾损伤尚未见有相关报道。我们在前期研究中发现，白头翁中含量较高的主要成分白头翁皂苷B4具有较好的抗炎作用，对于体外脂多糖(LPS)所致人胚肾细胞HEK293损伤具有一定的防治作用。为进一步证明B4具有防治肾功能损伤的作用，本团队利用多种常用方法所致动物急性肾功能损伤模型，从整体动物水平进一步确证B4的相关药效，同时还进行了小鼠LD50的测定，以期全面反映该药潜在的研究开发价值。

1 材料

1.1 细胞株

HEK293、人胚肾细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞库)。

1.2 动物

SD大鼠，体质量160～220 g，雄性，用于甘油所致大鼠急性肾损伤实验；ICR小鼠，体质量16～18 g，雄性，用于顺铂所致急性肾损伤实验；Balb/c小鼠，体质量21～23 g，雄性，用于LPS致急性肾损伤实验；ICR小鼠，体质量18～22 g，雄雌各半，用于急性毒性实验。上述大小鼠均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0002(小鼠)，许可证号：SCXK(湘)2013-0004(大鼠)。

1.3 药物与试剂

白头翁皂苷B4(anemoside B4，C59H96O26，分子量：1221.39，PubChem CID：11636713，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/71307558，分子结构式见图1。)，由本室植化组提供，纯度大于98%(HPLC法)，批号：20161107。

图1 白头翁皂苷B4化学结构

地塞米松，0.75g/片，安徽金太阳生化药业有限公司，批号：15032521。甘油(西陇化工股份有限公司，AR，含量﹥99%，批号：160320，临用前取甘油加等量的0.9%氯化钠溶液稀释成50%甘油溶液备用。顺铂(江苏豪森药业集团有限公司，5 mg·mL-1，批号：170503)，临用前用0.9%氯化钠溶液配成1.5 mg·mL-1溶液备用。脂多糖(LPS，Sigma公司，Lipopolysaccharides from Escherichia coli O555：B5，L2880-100MG，批号：017M4112V)，临用前用0.9%氯化钠溶液配成1.0 mg·mL-1溶液备用。BUN、TP生化试剂盒(日本纯药工业株式会社，批号分别为TR368、DF774)。Cre生化试剂盒(北京利德曼生化股份有限公司，批号：7082216)。Bradford蛋白浓度测定试剂盒(P0006，北京碧云天生物技术公司)。DMEM/HIGH CLUCOSE培养基(Hyclone，LOT No：AC10253739)。澳洲胎牛血清(Hyclone，货号：SH30084.03)。TRIzol(ambion公司)，LOT：15991210。Realtime PCR Super mix(MF013-01，北京聚合美生物科技有限责任公司，LOT：20170911)。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，基因序列如下：GAPDH，forward，5′-GGTGACTAACCCTGCGCT-3′，reverse，5′-TGACCAGGCGCCCAATAC-3′。TNF-α，forward，5′-AGCACTGAAAGCATCATCCG-3′，reverse，5′-CCGATCACTCCAAAGTGCA-3′。

1.4 仪器

Spectra Max i3型多功能酶标仪(Molecular Devices公司)，7100型全自动生化分析仪(日立公司)，TDZ4型台式低速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)，超净工作台[日本，SANYO MCV-B161S(T)]，CO2培养箱(日本，SANYO MCO-20ACI)，倒置显微镜(日本，OLYMPUS CKX4I)，7500荧光定量PCR仪(AB公司)，5810R冷冻离心机(德国Eppendorf)。

2 方法

2.1 B4抗LPS致HEK293细胞损伤

用DMEM高糖培养基将细胞复苏、传代，取对数生长期细胞，经消化后收集细胞接种于96孔板中，细胞密度为4.5×104个/mL，每孔接种100 μL，置37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h，弃去细胞上清液加入100 μL终质量浓度10 μg·mL-1的LPS诱导损伤，24 h后加入B4干预，B4终质量浓度为1、10、100 μg·mL-1，同时设置正常组(即不加LPS和B4)及模型组(即加LPS不加B4)。MTT法检测给药24 h和48 h细胞的活性(细胞活性=给药组平均吸光度/正常组平均吸光度×100%)。以上同样方法LPS诱导细胞损伤，收集B4给药24、48 h的细胞，按照试剂盒操作说明制备mRNA，并进行qPCR检测细胞中TNF-α的表达。

2.2 B4抗甘油所致大鼠急性肾功能损伤

取雄性SD大鼠，随机分为6组，每组10只。正常组、模型组、阳性组(地塞米松0.3 mg·kg-1)、B4高剂量组(2.5 mg·kg-1)、B4中剂量组(1.25 mg·kg-1)、B4低剂量组(0.625 mg·kg-1)。造模前禁水24 h，造成动物脱水，按10 mL·kg-1的体积分别在大鼠两后肢内侧肌肉内注射50%甘油溶液，复制急性肾损伤模型，造模后恢复饮水[14-15]。从造模当天开始连续给药4 d，正常组、阳性组灌胃给药(给药容积10 mL·kg-1)，模型组、B4组尾静脉注射(给药容积5 mL·kg-1)。末次给药后1 h，大鼠异氟烷麻醉后眼球取血，分离血清，采集膀胱尿，检测总蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、尿蛋白。

2.3 B4抗顺铂所致小鼠急性肾功能损伤

取雄性ICR小鼠，随机分为6组。按顺铂15 mg·kg-1的剂量造模，正常组腹腔注射0.9%氯化钠溶液，其他组腹腔注射顺铂注射液[16]。阳性组地塞米松给药剂量为0.5 mg·kg-1(灌胃给药，给药容积20 mL·kg-1)，B4给药剂量分别为10 mg·kg-1、5 mg·kg-1、2.5 mg·kg-1(尾静脉注射，注射容积10 mL·kg-1)，模型组尾静脉注射等容积的0.9%氯化钠溶液，正常组灌胃等容积双蒸水。从造模当天开始连续给药4 d，末次给药后1 h眼球取血，分离血清，全自动生化分析仪上检测总蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)。

2.4 B4抗LPS所致小鼠急性肾功能损伤

取雄性Balb/c小鼠，随机分为6组，每组15只。LPS静脉注射造模(剂量10 mg·kg-1)[17]。造模后6 h，各组给予不同剂量的药物，经过多次预试验，最终确定B4给药剂量分别为20、10、5 mg·kg-1(尾静脉注射，给药容积10 mL·kg-1)，阳性组地塞米松给药剂量为0.5 mg·kg-1(灌胃给药，容积20 mL·kg-1)。模型组腹腔注射等容积0.9%氯化钠溶液，正常组灌胃等容积的双蒸水。给药后6 h(即造模后12 h)眼眶取血，分离血清，检测总蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)。

2.5 小鼠急性毒性实验

取ICR小鼠60只，雄雌各半。随机分为6组，每组10只。对照组、B4的5个剂量组，剂量分别为6、4.8、3.84、3.07、2.46 g·kg-1，每组组间剂量比为1∶0.8。B4各剂量组尾静脉注射不同剂量的药物，给药容积为20～25 mL·kg-1，对照组注射20 mL·kg-1体积的0.9%氯化钠溶液，给药1次，观察2周。给药后观察动物体质量变化(每周称一次)、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况(记录累积死亡数)及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等。对濒死及死亡动物及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后进行大体解剖，观察动物主要脏器肝、脾脏、胸腺、肾、肺、心脏、小肠、胃等，对异常脏器进行组织病理学检查。根据死亡数计算死亡率，计算半数致死量(LD50)及95%可信限。

2.6 数据分析

3 结果

3.1 B4对LPS致HEK293细胞损伤的影响

结果显示，10 μg·mL-1的LPS诱导24 h后细胞活性明显下降，且炎性因子TNF-α表达显著上调，B4给药24、48 h后剂量1 μg·mL-1可明显增加细胞活性，且10 μg·mL-1及1 μg·mL-1能明显下调TNF-α mRNA的表达，提示B4对LPS诱导的肾细胞损伤有一定的保护作用(见图2)。

注：A.B4对LPS致HEK293损伤细胞活性的影响；B.B4给药24 h对LPS致细胞损伤TNF-α mRNA表达的影响；C.B4给药48 h对LPS致细胞损伤TNF-α mRNA表达的影响；与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

3.2 B4对甘油所致大鼠肾功能损伤的影响

模型组血清中BUN、Cre及其尿蛋白较正常组明显升高。B4静脉给药后高、中剂量组大鼠血清BUN、Cre明显下降，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。B4高剂量组大鼠尿蛋白浓度明显下降(P<0.05)，表明B4对甘油所致大鼠急性肾损伤有一定的保护作用。阳性对照药地塞米松也在一定程度上保护肾功能，但对尿蛋白无明显作用，各组大鼠血清总蛋白量差异无统计学意义(见图3)。

注：A.B4对TP的影响；B.B4对Cre的影响；C.B4对BUN的影响；D.B4对尿蛋白的影响；与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05；NS表示差异无统计学意义。

3.3 B4对顺铂所致小鼠肾功能损伤的影响

模型组血清中BUN、Cre较正常组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。B4(10 mg·kg-1)、B4(5 mg·kg-1)组血清BUN、Cre明显下降，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示B4对顺铂所致急性肾损伤有一定的保护作用，能显著降低急性肾损伤时的BUN、Cre。阳性组血清BUN明显下降(P<0.05)，对Cre无明显作用。B4各组小鼠血清总蛋白量无明显差异。结果见表1。

表1 B4对顺铂所致小鼠急性肾功能损伤的影响

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 B4对LPS所致小鼠肾功能损伤的影响

模型组静脉注射LPS 12 h后，小鼠血清总蛋白明显下降，BUN和Cre明显升高，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01)。给药后6 h，B4的3个剂量组血清BUN明显降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但对Cre则未表现出明显的作用。阳性药对血清BUN也表现出明显的下调作用。结果见表2。

表2 B4对LPS致小鼠急性肾功能损伤的影响

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.5 小鼠急性毒性实验

静脉注射不同剂量的B4，各组小鼠表现出不同的反应。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ剂量组动物给药后自主活动减少，对外反应冷漠，部分动物出现竖毛、消瘦等现象。剂量Ⅰ、Ⅱ组动物死亡时间主要集中在给药后24～36 h，剂量Ⅲ组死亡时间在给药后36 h，剂量Ⅳ组动物死亡时间为给药后72 h内，Ⅴ剂量组无动物死亡。各组小鼠死亡率见表3。采用寇氏式法计算，B4静脉注射给药小鼠LD50值为3.36 g·kg-1，95%可信限为3.34～3.37 g·kg-1。

表3 B4静脉注射给药所致小鼠死亡率

注：“()”为雄性小鼠死亡数。

4 讨论

本研究利用甘油、顺铂和LPS造模，观察了B4对急性肾功能损伤的保护作用。甘油引起急性肾功能损伤的原理是肌肉注射甘油后，由于禁水及甘油的高渗透压造成局部体液蓄积而引起血容量降低，肾血流量减少，血液黏度增加，肾血管阻抗增加，血管自身调节功能丧失，导致肾小球滤过率下降。另外，高渗透压造成肌肉及肌肉血管的溶解，肌红蛋白、血红蛋白及钾的释放产生肾毒性最终造成肾小球及肾小管损伤[19-21]。顺铂为一临床常用的非特异性抗肿瘤药，其细胞毒性对肿瘤进行杀伤的同时，也不可避免地对正常组织细胞产生毒性，因此顺铂在抗肿瘤过程中常导致肾功能损伤已为临床所常见[22]。腹腔注射顺铂后，可引起肾血管收缩，肾血流量及肾小球滤过率下降，从而引起蛋白尿、肾功能损伤等症状[23-24]，对肾脏的不同部位均有毒性，可使肾小球、肾小管功能及形态学改变。LPS诱导的急性肾损伤是其通过激活TLR2/4信号通路，刺激组织细胞炎性坏死因子表达，进而对正常组织细胞产生损伤，其中以肾功能损伤较为明显[25-27]。我们利用上述3种常规方法对B4防治急性实验性肾功能损伤的作用进行了观察，结果表明，B4对这3种模型的急性肾功能损伤均有明显的保护作用，同时根据体外LPS致人胚肾细胞损伤实验结果显示B4对LPS所致炎症反应有明显抑制作用，提示该药在此方面的潜在的药用价值。

急性肾损伤主要是炎性坏死病理反应，其中最常发生变化的就是TLR4及其下游信号通路，如核因子NFκB及炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6等。近年来，越来越多的研究表明，Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)在多种肾脏疾病中发挥着重要的作用，尤其是TLR2和TLR4[28]。综合文献关于B4具有抗炎抗癌作用以及抗溃疡性结肠炎的药代相关研究报道，可见B4对于炎症反应具有一定抑制作用。同时本研究在甘油致大鼠的急性肾损伤的实验中发现，B4可降低肾损伤大鼠尿液中白蛋白量，提示其对肾小球滤过功能有一定的修复作用，对于B4抗肾损伤作用机制研究可从改善肾小球滤过功能，如肾小球基底膜上的足细胞等方面开展。关于B4对急性肾损伤的保护作用机制有待进一步深入研究。

在急性肾功能损伤模型的实验中，B4对不同原因的模型所用剂量不同。其中对LPS所致急性肾功能损伤的有效剂量在5～20 mg·kg-1。而对顺铂所致急性肾功能损伤的有效剂量在5～10 mg·kg-1，2.5 mg·kg-1剂量未表现出明显的作用。在甘油所致大鼠急性肾功能损伤模型实验中，B4的有效剂量在1.25～2.50 mg·kg-1，按照大小鼠体表面积计算，此剂量相当于小鼠的2.5～5.0 mg·kg-1。由此提示对于实验性急性肾功能损伤模型实验中，B4的有效剂量在5～20 mg·kg-1，当然最终有效剂量的确定还需要更多实验的验证，其中对慢性肾功能损伤的作用有待于进一步研究。

小鼠以B4静脉给药，LD50为3.36 g·kg-1，毒性较小。以最大有效剂量20 mg·kg-1计，B4的临床安全指数(safety index)为168(3.36/0.02)，提示B4在防治急性肾功能损伤方面的安全系数较大。在急性毒性实验中可见，B4毒性的产生有一个关键节点，即剂量在3.84～3.07 mg·kg-1时，剂量为3.84 mg·kg-1时，小鼠死亡率为100%；而剂量降至3.07 mg·kg-1时，小鼠死亡率明显下降至仅为10%。B4表现出毒性的骤然性变化，其中的机制尚待于进一步研究。

综上，B4以其毒性较低、治疗指数较高等特点，在防治急性肾功能损伤方面具有一定的药用开发价值，本工作提供了重要的实验参考。