杨世荣 陈艳琴 白翔宇 甘露 何显力

结直肠癌发病率和死亡率在世界范围内分别位居第三和第二位［1］。大多结直肠癌患者确诊时已处于中晚期，患者预后差异较大。但目前结直肠癌发病及进展的机制尚不完全清楚，可用于预测患者预后的标志物亦有限。线粒体是一种能量供应的重要细胞器，参与ATP合成，可调控细胞氧化还原状态，介导细胞信号转导、细胞凋亡和生物合成代谢等［2］。大量研究证实，线粒体功能异常几乎在所有肿瘤进展中发挥关键调控作用［3-6］。线粒体转录因子 B1（mitochondria transcription factor B1，TFB1M）是线粒体转录起始因子，在调控线粒体氧化磷酸化相关蛋白质合成中发挥重要作用，已被证实在多种实体肿瘤中表达异常［7-8］，但在结直肠癌中的作用尚不明确。本研究通过检测结直肠癌组织中TFB1M的表达并利用癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）公共数据库的结直肠癌患者转录组数据及临床样本信息，分析TFB1M表达与患者预后的相关性，同时在结直肠癌细胞中调控TFB1M的表达后观察其对细胞增殖的影响，探讨TFB1M与结直肠癌的关系，为结直肠癌患者预后预测及治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

人结直肠癌细胞株SW620和HCT116购自ATCC细胞库。胎牛血清购自中国BBI Life Sciences公司，青链霉素混合液购自中国索莱宝公司，DMEM培养基购自中国瑞博公司，BCA蛋白定量试剂盒购自中国碧云天公司，蛋白Marker购自美国Thermo Fisher公司，MTS检测试剂盒购自美国 Promega公司，β-actin抗体和兔二抗购自中国北京天德悦公司，TFB1M抗体购自美国OriGene公司，携带TFB1M干涉、过表达质粒的慢病毒购自中国上海吉玛基因公司。

1.2 组织样本来源

收集2015年1月至2019年1月于空军军医大学唐都医院手术治疗的112例结直肠癌患者的临床资料。所有患者术前均未经任何抗肿瘤治疗，其癌组织及相应癌旁正常组织标本均经病理检查确诊，并由2位病理学医师诊断及复核。所有组织样本取下后立即液氮冷冻，-80℃冰箱保存。本研究获得空军军医大学唐都医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。中位随访时间为28个月，总生存期定义为手术日至患者死亡或末次随访的时间。

1.3 免疫组织化学法检测TFB1M的表达

组织标本经10%中性福尔马林缓冲液固定，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋，4 μm厚连续切片。石蜡切片常规烤片、脱蜡后用柠檬酸钠进行抗原高压修复，山羊血清室温封闭，滴加稀释的TFB1M抗体（1∶800），4℃孵育过夜，兔二抗室温孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。以PBS代替一抗为阴性对照。细胞染色强度评分：无染色计0分，黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。细胞阳性率评分：0～9%计0分，10%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，76%～100%计4分。阳性综合评分为染色强度评分与阳性细胞率评分的乘积：≤3分为低表达，＞3分为高表达。

1.4 TCGA数据分析

利用Bioconductor/TCGAbiolinks函数包从TCGA（http：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/） 数据库下载 575 例结直肠癌患者的mRNA表达二代测序数据及相应的临床信息。以基因表达中位值（5.8）分组，＞5.8为TFB1M高表达组，≤5.8为TFB1M低表达组。

1.5 细胞培养和慢病毒转染

人结直肠癌细胞SW620和HCT116用含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。胰蛋白酶消化处于对数生长期细胞，以5×104/孔接种于6孔板，实验分为4组：shCtrl组转染阴性干涉质粒慢病毒，shTFB1M组转染TFB1M干涉质粒慢病毒，EV组转染含空载质粒慢病毒，TFB1M组转染含TFB1M过表达质粒的慢病毒。待细胞贴壁后进行慢病毒转染：960 μL无血清DMEM培养基+40 μL感染增强液+5 μL病毒原液（病毒浓度为1×108/mL），10 h后更换含血清培养基。转染48 h后用荧光倒置显微镜观察转染效率，采用嘌呤霉素（浓度为5 ng/mL）进行病毒转染抗性筛选。

1.6 Western blot检测TFB1M的表达

RIPA裂解液裂解细胞后提取细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度，调节蛋白浓度并添加5×蛋白上样缓冲液，100℃水浴10 min后上样，10%聚丙烯酰胺分离凝胶电泳，转至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭，添加一抗TFB1M（稀释比例为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；二抗β-actin（稀释比较为1∶3 000）室温孵育1 h，TBST洗涤液清洗，然后采用荧光成像进行定量检测，Image J软件分析条带，以β-actin蛋白条带灰度值为参照。

1.7 MTS法检测细胞增殖能力

胰蛋白酶消化对数生长期的慢病毒稳定转染SW620和HCT116细胞，以2×103/孔细胞密度接种至96孔板，设5个复孔及阴性对照，待细胞贴壁后加入20 μL/孔MTS工作液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育1 h。利用酶标仪于490 nm波长处检测各孔吸光度值，记录为起始数据（0 h），同样方法分别于 24 h，48 h，72 h，96 h再次检测，根据记录数据绘制细胞增殖曲线。

1.8 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用独立样本t检验；采用Kaplan-Meier法计算生存率，两组生存曲线比较采用Log-rank检验，Cox等比例风险回归模型分析TFB1M表达水平与总生存期的关系，计算风险比（HR）及其对应的95%可信区间（CI）。shCtrl组和shTFB1M组细胞增殖能力的差异，采用重复测量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TFB1M在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的表达

免疫组织化学法检测结果显示，TFB1M主要染色于细胞质，癌旁正常结肠上皮细胞大部分呈中至强染色，结直肠癌细胞呈部分弱染色。结直肠癌组织及其癌旁正常组织中TFB1M的阳性表达评分分别为（3.79±1.66）分和（8.14±1.82）分，差异有统计学意义（P＜0.01），见图 1。

图1 TFB1M在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的表达（SP×200）Fig.1 Expression of TFB1M in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues（SP×200）

2.2 基于TCGA数据库分析TFB1M表达与结直肠癌患者临床特征及预后的关系

TCGA公共数据库数据分析显示，TFB1M在Ⅲ+Ⅳ期患者癌组织中的表达较Ⅰ+Ⅱ期患者显著降低（P=0.010），而不同年龄、性别患者TFB1M表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。Kaplan-Meier生存分析显示，TFB1M高表达患者和低表达患者的中位生存时间分别为99个月和79个月，两组生存曲线比较差异有统计学意义（P=0.038），见图2。

表1 TCGA数据库中TFB1M表达与结直肠癌患者临床特征的关系Tab.1 The relationship between the expression of TFB1M and clinical features of patients with colorectal cancer of TCGA

图2 TCGA数据库中TFB1M表达与结直肠癌患者预后的关系Fig.2 The relationship between expression of TFB1M and prognosis of patients with colorectal cancer of TCGA

2.3 基于TCGA数据库的单因素和多因素分析

基于TCGA数据库的单因素Cox模型分析结果显示，TFB1M mRNA表达水平、年龄、TNM分期与结直肠癌患者术后总生存期有关（P＜0.05），多因素Cox模型分析显示，年龄、TNM分期和TFB1M mRNA表达水平是影响结直肠癌患者术后总生存期的独立因素（P＜0.05），见表 2。

表2 TCGA数据库中结直肠癌患者术后总生存期的单因素和多因素分析Tab.2 Univariate analysis and multivariate analysis of postoperative overall survival in patients with colorectal cancer of TCGA

2.4 基于临床样本分析TFB1M表达与结直肠癌患者临床特征及预后的关系

不同年龄、性别的结直肠癌患者TFB1M表达差异无统计学意义（P＞0.05），但TFB1M在Ⅲ+Ⅳ期患者中的表达较Ⅰ+Ⅱ期患者显著降低，差异有统计学意义（P=0.005），见表 3。Kaplan-Meier生存分析显示，TFB1M高表达患者和低表达患者的中位生存时间分别为33个月和23个月，两组生存曲线比较差异有统计学意义（P=0.008），见图 3。

2.5 基于临床样本的单因素和多因素分析

单因素Cox模型分析发现，TFB1M蛋白表达水平（P=0.002）、年龄（P=0.005）和 TMN 分期（P＜0.001）与结直肠癌患者总生存期有关。多因素Cox模型分析显示TFB1M表达水平是影响结直肠癌患者总生存期的独立因素（P=0.029）。见表4。

2.6 慢病毒转染结直肠癌细胞SW620和HCT116后TFB1M的表达水平

Western blot检测结果显示，SW620细胞和HCT116细胞中，shTFB1M组TFB1M表达均较shCtrl组显著降低（0.32±0.03 vs 0.93±0.12，P＜0.001；0.17±0.05 vs 0.56±0.11，P＜0.001），而 TFB1M 组 TFB1M 的表达均显著高于 EV 组（1.49±0.19 vs 0.94±0.08，P＜0.001；1.63±0.08 vs 0.62±0.06，P＜0.001），见图4。说明TFB1M干涉和过表达结直肠癌细胞SW620和HCT116构建成功。

2.7 干涉/过表达TFB1M对结直肠癌细胞增殖能力的影响

MTS实验检测结果显示，SW620细胞和HCT116细胞中，shTFB1M组的细胞增殖能力均较shCtrl组显著增强（F=80.6，P＜0.001；F=532.6，P＜0.001），而 TFB1M组细胞增殖能力均较EV组下降（F=130.2，P＜0.001；F=55.0，P=0.002），见图 5。

图3 TFB1M表达与结直肠癌患者预后的关系Fig.3 The relationship between expression of TFB1M and prognosis of patients with colorectal cancer

表3 TFB1M表达与结直肠癌患者临床特征的关系Tab.3 The relationship between the expression of TFB1M and clinical features of patients with colorectal cancer

表4 影响结直肠癌患者术后总生存期的单因素和多因素分析Tab.4 Univariate analysis and multivariate analysis of postoperative overall survival in patients with colorectal cancer

图4 Western blot检测转染后SW620和HCT116细胞中TFB1M蛋白的表达Fig.4 Expression of TFB1M in SW620 and HCT116 cells after lentivirus transfection were detected by Western blot

图5 MTS法检测干涉/过表达TFB1M后结直肠癌细胞SW620和HCT116的增殖能力Fig.5 The proliferation of SW620 and HCT116 cells after interference/overexpression of TFB1M detected by MTS

3 讨论

结直肠癌的发生是遗传因素和环境因素共同作用的复杂过程［9］。结直肠癌进展过程中，细胞能量代谢变化和活性氧等信号转导发挥着重要调控作用［10］。线粒体是细胞重要的能量代谢枢纽，也是活性氧和活性氮的重要来源，在肿瘤进展各个阶段可通过代谢重编程、分裂融合、氧化还原稳态、氧化应激信号传导等方式影响肿瘤细胞生长和生存。线粒体DNA（mtDNA）具有独立的环状双链DNA，由线粒体RNA聚合酶（mtRNAP）、线粒体转录因子 A（TFAM）、TFB1M、线粒体转录因子B2（TFB2M）组成的转录起始复合物可参与mtDNA上各种基因的转录调控，从而影响线粒体功能发挥［8］。TFB1M作为转录起始复合物的重要组成部分，其表达异常可直接影响细胞线粒体的功能发挥［11］。研究发现与TFB1M功能相似的其他线粒体转录因子，如TFAM 在肾细胞癌［12］和肺癌［13］等多种肿瘤中发挥重要作用。在结直肠癌中，TFAM的杂合性缺失可导致肠上皮细胞线粒体功能异常、活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄积，进而促进小鼠肠道自发成瘤［14］。同样在微卫星不稳定结直肠癌中，TFAM框移突变也可通过降低mtDNA拷贝数而诱导结直肠癌细胞对顺铂等化疗药物抵抗［15］。以上研究提示线粒体相关转录因子在恶性肿瘤发生进展中发挥着重要作用。

本研究收集结直肠癌患者手术切除样本及临床资料，免疫组织化学法检测证实TFB1M在结直肠癌组织中表达下调，结合TCGA公共数据库中结直肠癌组织表达谱数据和临床样本信息分析TFB1M与患者临床病理特征的关系，结果发现两组数据中TFB1M在Ⅲ+Ⅳ期患者中的表达均较Ⅰ+Ⅱ期患者显著降低，且TFB1M低表达患者术后总生存期显著低于高表达患者，多因素Cox回归分析发现TFB1M是影响患者总生存的独立因素，说明TFB1M可能参与结直肠癌发生，且TFB1M低表达患者预后不良。本研究进一步在细胞水平研究TFB1M与结直肠癌的关系，通过慢病毒转染法分别在结直肠癌SW620和HCT116细胞中干涉和过表达TFB1M，结果发现干涉TFB1M可显著促进结直肠癌SW620和HCT116细胞的增殖能力，而过表达TFB1M则抑制其增殖能力，初步证实TFB1M表达异常可能通过影响线粒体功能而对结直肠癌细胞增殖发挥调控作用。既往有研究报道TFB1M缺失可导致细胞线粒体功能异常，进而引起活性氧蓄积［16］。而ROS与肿瘤发生进展密切相关，可引起细胞中包括DNA在内的大分子损伤，是体内诱导细胞癌变的重要危险因素［17-18］。TFB1M在结直肠癌中表达降低是否通过引起ROS蓄积，进而促进抑癌基因突变和促癌基因活化导致细胞增殖能力增强仍有待进一步探讨。

本研究通过公共数据分析和临床样本验证，以及体外细胞实验证实TFB1M在结直肠癌中低表达，且低表达者预后较差，干涉TFB1M可促进结直肠癌细胞增殖，TFB1M可能是结直肠癌潜在的预后评估标志物和治疗靶点。但本研究纳入临床样本量有限，TFB1M在结直肠癌中表达异常及其与患者预后的相关性，以及在结直肠癌发生发展中的具体作用仍需扩大临床样本量及动物模型进一步研究。