陈莉 林国享 陈凯华 孙永楚 万芳竹 朱小东，

鼻咽癌是我国高发的恶性肿瘤之一，放疗是主要的治疗手段［1-2］。而抗辐射是患者复发、转移及治疗失败的主要原因［3］。因此，探讨抗辐射鼻咽癌细胞迁移和侵袭机制有重要意义。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是常见的促血管内皮细胞生长因子，可诱导血管形成，增加血管通透性，影响肿瘤微环境中免疫细胞的功能［4］。VEGF还能促进癌细胞DNA过度复制，诱导放射抗性基因合成，从而产生放射抵抗［5］。研究发现VEGF在多种恶性肿瘤组织，包括鼻咽癌组织中呈高表达，可能参与肿瘤远处转移，且与不良预后有关［6-10］。本研究通过构建VEGF沉默表达的鼻咽癌放射抗拒细胞株，探讨VEGF对细胞侵袭和迁移能力的影响，以期寻找鼻咽癌放射抗拒靶点，为阐明鼻咽癌转移机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R由广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部构建并保存。GV248慢病毒质粒骨架（hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin）、293T 细胞、大肠杆菌菌株 DH5α、慢病毒包装辅助质粒pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体和嘌呤霉素均购自上海吉凯基因技术有限公司；GAPDH引物购自上海生工生物工程技术有限公司；VEGF引物由日本Takara公司设计并合成；鼠抗人VEGF-A抗体购自美国NOVUS公司；兔抗人GAPDH抗体购自美国CST公司；山羊抗兔二抗、抗鼠二抗购自上海碧云天技术有限公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，凝胶成像分析仪购自美国Bio-Rad公司，荧光定量PCR仪购自德国Analytik Jena公司。

1.2 重组慢病毒表达质粒及慢病毒构建

在GenBank中搜索人VEGF核苷酸序列（编号：NM_001171626），设计3个干扰VEGF的靶点序列（LV1、LV2和LV3）和1条无关序列（NC）。根据各靶序列分别设计并合成shRNA的单链DNA Oligo（内含AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位点），构建重组慢病毒表达质粒GV248-LV1、GV248-LV2、GV248-LV3 和 GV248-NC，进行双酶切鉴定和测序验证。293T细胞置于37℃、5%CO2条件下培养24 h，融合度达70%～80%时将上述4种重组慢病毒表达质粒、pHelper 1.0载体质粒、pHelper 2.0载体质粒与Lipofectamine 2000转染试剂混合培养48 h，离心后获得重组慢病毒原液VEGF-LV1、VEGF-LV2、VEGF-LV3 和 VEGF-NC，分装并于-80℃下保存。

1.3 病毒滴度测定

293T细胞接种于96孔板（4×103/孔）培养24 h后，分别将 10 μL、1 μL 和 0.1 μL的慢病毒原液 VEGF-LV1、VEGF-LV2、VEGF-LV3和VEGF-NC与完全培养基混合成100 μL转染液。选取所需的293T细胞孔，加入病毒转染液培养4 d，用倒置荧光显微镜观察荧光表达情况，计算重组慢病毒滴度，以及当MOI=20时所需的转染病毒体积，进行下一步慢病毒转染。重组慢病毒滴度=荧光细胞数/病毒原液量。MOI=病毒滴度×病毒体积/细胞数目。

1.4 构建稳定转染VEGF的CNE-2R细胞系

CNE-2R细胞接种于含10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL链霉素的RPMI-1640完全培养基，用胰酶消化并传代培养。取对数生长期的CNE-2R细胞接种于24孔板（2.5×104/孔）；培养 24 h后，分别转染 1.250 μL VEGF-LV1、1.111 μL VEGF-LV2、1.429 μL VEGF-LV3和1.111 μL VEGF-NC；用嘌呤霉素筛选转染后细胞，获得稳定传代的转染细胞系，分别记为CNE-LV1组、CNE-LV2组、CNE-LV3组和CNE-NC组，同时设CNE-2R细胞为空白对照组。在倒置荧光显微镜（×200）下观察各组细胞荧光表达情况并计算转染效率。转染效率=（荧光细胞数/总细胞数）×100%。

1.5 RT-qPCR检测VEGF mRNA的表达

收集以上各组细胞，按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，采用Primer ScriptTMRT试剂盒将RNA逆转录成cDNA。以GAPDH为内参，进行实时荧光定量PCR检测。引物序列：VEGF-F为5'-TCACAGGTACAGGGATGAGGACAC-3'，VEGF-R 为 5'-CAAAGCACAGCAATGTCCTGAAG-3'；GAPDH-F 为 5'-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'，GAPDH-R 为 5'-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3'。PCR 反应条件：预变性95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。采用 2-△△Ct法计算VEGF mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.6 Western blot检测VEGF蛋白的表达

采用RIPA蛋白裂解液提取各组细胞总蛋白，根据BCA法进行蛋白定量检测，取各组蛋白质20 μg，加入适量上样缓冲液，混匀，凝胶电泳，湿转法转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。加入稀释的一抗［VEGF（1∶1 000）和 GAPDH（1∶1 000）］，4 ℃下摇床孵育过夜，洗膜后加入稀释的二抗（1∶1 000），室温孵育1 h后洗膜。采用ECL化学发光法曝光，凝胶成像系统拍照分析并检测各条带灰度值。实验重复3次。

1.7 划痕实验检测细胞迁移能力

收集处于对数生长期的各组细胞，经胰酶消化重悬后，按4×105/孔接种于6孔板中。待细胞融合度约为80%时，用200μL移液器枪头在孔板上作划痕标记，用完全培养基连续培养48 h。显微镜观察0 h、48 h细胞划痕愈合情况。实验重复3次。

1.8 Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力

用不含血清的培养基将各组细胞重悬成3×105/mL的细胞悬液，并分别接种于含Matrigel基质胶和不含Matrigel基质胶的24孔板Transwell小室上室中，200μL/孔。下室中加入600μL完全培养基，并于37℃、5%CO2条件下培养48 h。用棉签擦去上室中的细胞，PBS清洗，4%多聚甲醛固定40 min，姬姆萨染液染色45 min，再用 PBS清洗，晾干，在倒置显微镜（×200）下观察并拍照，计数5个视野的细胞数。实验重复3次。

1.9 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，进一步的两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组慢病毒表达质粒双酶切鉴定和测序验证结果

重组慢病毒表达质粒双酶切鉴定结果显示，环状质粒被切断后呈线性条带改变，说明双酶切位点正确，见图1。经测序进一步鉴定，GV248-LV1组、GV248-LV2组和GV248-LV3组相应的干扰shRNA序列成功连接到载体中，表明重组质粒构建成功，见图2。

图1 GV248-VEGF质粒的酶切电泳图Fig.1 Enzymatic digestion electrophoresis of GV248-VEGF plasmid

图2 GV248-VEGF插入序列的测序峰Fig.2 Sequencing peak of insertion sequence of GV248-VEGF

2.2 重组慢病毒的滴度

倒置荧光显微镜观察结果显示，转染慢病毒的4组细胞荧光强度随着病毒原液体积的增加而增强，见图3。当病毒原液量为 0.1 μL时，VEGF-LV1组、VEGF-LV2组、VEGF-LV3组和VEGF-NC组的荧光细胞数分别为 8×104个、9×104个、7×104个和 9×104个；慢病毒的滴度分别为 8×108TU/mL、9×108TU/mL、7×108TU/mL、9×108TU/mL；当 MOI=20 时，慢病毒转染实验所需病毒原液体积分别为1.250 μL、1.111 μL、1.429 μL、1.111 μL。

图3 不同体积重组慢病毒对293T细胞的转染效果（×200）Fig.3 Transfection effect of different volumes of recombinant lentivirus on 293T cells（×200）

2.3 构建稳定沉默VEGF的CNE-2R细胞

倒置荧光显微镜观察结果显示，4种慢病毒分别转染CNE-2R细胞后均带有绿色荧光，转染效率＞90%（图4），说明转染成功。RT-qPCR检测（图 5A）和 Western blot检测（图5B）结果显示，空白对照组、CNE-NC组、CNE-LV1组、CNE-LV2组和CNE-LV3组的VEGF mRNA和蛋白表达量差异均有统计学意义（F=4.129，P＜0.001；F=571.194，P=0.031），其中 CNE-LV3组VEGF的mRNA和蛋白表达量均低于其余4组（P＜0.05）。以上结果表明，CNE-LV3组细胞沉默VEGF效果最佳，以其进行后续实验。

2.4 沉默VEGF对CNE-2R细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，空白对照组、CNE-NC组、CNE-LV3组的细胞迁移率分别为（50.17±1.76）%、（50.63±1.52）%、（37.97±1.56）%，组间差异有统计学意义（F=59.292，P＜0.001）；与空白对照组和 CNE-NC组相比，CNE-LV3组细胞迁移率均下降（t=8.989，P＝0.001；t=10.070，P=0.001），但空白对照组与 CNE-NC组差异无统计学意义（t=0.348，P＝0.746），见图 6A。

Transwell小室迁移实验结果显示，空白对照组、CNE-NC组、CNE-LV3组的穿膜细胞数分别为（95.3±3.8）个、（94.3±4.0）个、（41.3±1.5）个，组间比较差异有统计学意义（F=261.347，P＜0.001）；与空白对照组和CNE-NC组相比，CNE-LV3组穿膜细胞数明显减少（t=22.910，P＜0.001；t=21.305，P＜0.001）；而空白对照组与CNE-NC组比较，差异无统计学意义（t=0.419，P＝0.697），见图 6B。

图4 重组慢病毒转染CNE-2R细胞的效果（×200）Fig.4 Transfection effect of recombinant lentivirus on CNE-2R cells（×200）

图5 转染后CNE-2R细胞VEGF mRNA及蛋白的表达情况Fig.5 Expression of VEGF mRNA and protein in CNE-2R cells after transfection

图6 沉默VEGF对CNE-2R细胞迁移能力的影响Fig.6 Effect of silencing the expression of VEGF on the migration ability of CNE-2R cells

2.5 沉默VEGF对CNE-2R细胞侵袭能力的影响

Transwell小室侵袭实验结果显示，空白对照组、CNE-NC组、CNE-LV3组的细胞穿膜数分别为（105.3±1.5）个、（93.3±2.5）个、（46.3±2.1）个，组间差异有统计学意义（F=774.886，P<0.001）。CNE-LV3组细胞穿膜数分别与空白对照组和CNE-NC组比较，差异有统计学意义（t=38.711，P＜0.001；t=30.237，P＜0.001）；而空白对照组与CNE-NC组比较，差异无统计学意义（t=1.877，P＝0.134）。见图 7。

图7 沉默VEGF对CNE-2R细胞侵袭能力的影响（×200）Fig.7 Effect of silencing the expression of VEGF on the invasion ability of CNE-2R cells（×200）

3 讨论

正常的血管形成受血管生成因子和抗血管生成因子共同调控，当促血管生成因子过度活跃时，可导致血管持续性生长，使肿瘤血管异常形成［11］。VEGF广泛存在于人体各器官，其表达受多种因素调控。在肿瘤发生发展中，肿瘤细胞能分泌较高水平的VEGF，从而引发肿瘤血管内皮细胞有丝分裂，促进血管形成；同时VEGF还可促进单核细胞、成纤维细胞浸润，从而形成肿瘤基质并促进肿瘤细胞进入新生血管内，进而增强肿瘤细胞转移能力［12］。研究发现，VEGF对鼻咽癌预后产生不良影响［13-15］。

本课题组前期研究证实构建的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R较CNE-2细胞具有更高的侵袭迁移能力［16］。RNA干扰技术可特异性沉默特定基因的表达，且具有级联放大效应和可遗传性，目前已广泛应用于探索基因功能、恶性肿瘤治疗等。沉默基因表达的RNA干扰载体包括慢病毒、腺病毒、质粒和siRNA化学合成等，其中慢病毒载体可转染多种类型细胞，具有转染效率高、可插入的基因片段多、表达稳定等优点［17］。本研究制备3种靶向干扰VEGF基因的慢病毒载体，转染人鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R。鉴于本课题组前期实验发现MOI=20时慢病毒转染效果最佳［18］，因此选取MOI=20时转染所需的病毒体积转染CNE-2R细胞，结果均成功构建了沉默VEGF的CNE-2R细胞，其中CNE-LV3组VEGF沉默效果最佳，用于后续实验。VEGF沉默CNE-LV3细胞的成功构建，为进一步探讨VEGF对鼻咽癌转移的影响奠定了实验基础。

HE等［19］研究发现，沉默NETO2可降低鼻咽癌CNE-1、HONE-1细胞的侵袭和迁移能力。也有研究表明上调VEGF表达可促进胰腺癌细胞、卵巢癌细胞和肝癌细胞的侵袭和迁移能力［20-22］，而抑制VEGF表达则可减弱黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞的转移能力［23-25］。本研究划痕实验和Transwell小室实验结果显示，CNE-LV3组细胞较空白对照组和CNE-NC组细胞覆盖划痕区域的速度慢，细胞迁移率显著降低；细胞迁移和侵袭的穿膜细胞数亦明显减少，表明沉默VEGF能抑制鼻咽癌CNE-2R细胞的迁移和侵袭能力。VEGF可能是抑制放射抗拒性鼻咽癌转移的有效靶点。但目前VEGF导致鼻咽癌转移的具体作用机制尚未明确，后期将在分子和动物水平进一步探索VEGF对鼻咽癌侵袭迁移能力的影响。

本研究成功构建了沉默VEGF表达的鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞株，且沉默VEGF能有效抑制细胞迁移和侵袭能力，VEGF可能是抑制放射抗拒性鼻咽癌转移的有效靶点，以VEGF为靶点的治疗方法有望为鼻咽癌治疗提供新的思路。