FTIR、ATR-FTIR和UV多光谱鉴别不同产地重楼

2019-01-22裴艺菲左智天赵艳丽张庆芝王元忠

分析测试学报 2019年1期

裴艺菲，左智天，赵艳丽，张庆芝，王元忠*

(1.云南中医学院中药学院，云南昆明 650500；2.云南省农业科学院药用植物研究所，云南昆明 650200)

重楼为百合科植物云南重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand-Mazz.或七叶一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara的干燥根茎,苦，微寒，有小毒，归肝经，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效；外用于疔疮痈肿、咽喉肿痛、蛇虫咬伤、跌扑伤痛及惊风抽搐[1]。植物化学研究发现，重楼的主要化学成分为甾体皂苷类，此外，还含有多糖、黄酮、氨基酸等[2]。重楼具有抗肿瘤、抑菌、止血、免疫调节、抗氧化、肝脏保护、抑制血管生成等作用[3]，被广泛应用于中成药，如云南白药系列、宫血宁胶囊、清热止咳颗粒、复方蛇胆川贝散、复方重楼酊等。

调查发现，云南省中药材市场重楼药材质量参差不齐，价格差异较大。前人研究发现不同生长环境会形成胶质和粉质重楼，两种质地重楼活性成分与药理作用存在较大差异，从而影响重楼药材及其中成药质量，进而影响临床疗效[4]。目前，对于重楼化学成分的定性定量分析，主要采用高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)、超高效液相色谱(Ultra high performance liquid chromatography,UHPLC)、红外光谱(Infrared spectra,IR)、紫外光谱(Ultraviolet,UV)、质谱(Mass spectrometry,MS)等单一或多种技术联用的方法[5-9]。Yang等[10]利用UHPLC-UV-MS和UV结合多元统计分析对3个不同地区的云南重楼进行区分，定量分析结果表明云南南部地区重楼中的总皂苷含量(19.9 mg·g-1)高于中部地区(8.79 mg·g-1)，进一步鉴别分析发现，UV比UHPLC更适于区别3个区域样品,200～300 nm被认为是区分不同区域云南重楼的重要波长范围。

UV可快速准确地测定化合物含量[11]。傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)因具有简便无损的特点，已被应用于食品及中药材掺假鉴定、优劣鉴定、产地溯源、化学成分分析等方面[12]。衰减全反射傅立叶变换红外光谱(Attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR)通过配备石英、锗、硒化锌等晶体材料ATR附件，简化了样品处理过程，提高了FTIR采样成功率，作为一种快速无损的分析技术广泛用于中草药和食品化学成分研究领域[12-13]。Cebi等[14]将ATR-FTIR技术与化学计量学相结合检测中药减肥茶中的西布曲明，方法稳定可靠。Nikzad-Langerodi等[15]利用ATR-FTIR技术结合生物活性数据建立了不同金银花乙醇提取物抗炎特性的正交偏最小二乘判别模型，成功预测了提取物抑制炎症反应的能力。FTIR及ATR-FTIR一般采用400～4 000 cm-1波数范围，UV采用190～380 nm波长范围。由于不同技术提供互补信息可得到比单一技术更好的结果，使得数据融合策略逐步应用于中药基原鉴定等方面[16]。Yang等[17]将UV与FTIR(KBr压片法测量)两种光谱数据与化学计量学进行串联融合，建立了偏最小二乘判别分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)与支持向量机(Support vector machine,SVM)判别模型，对采自云南的重楼样品进行产地鉴别，经筛选变量得到的中级融合分类效果较好；其正确率均达到80%以上，但并未获得最佳鉴别效果。

为比较ATR-FTIR与FTIR的采集信息差异及模型分类效果，本研究拟使用ATR附件及KBr压片技术分别测定重楼FTIR信息。采集云南省昆明市、怒江州、文山州、西双版纳傣族自治州及贵州省安顺市、兴义市6个产地重楼根茎的FTIR、ATR-FTIR、UV，建立单一光谱、低级数据融合(FTIR-UV及ATR-FTIR-UV)PLS-DA与SVM判别模型，旨在对FTIR与ATR-FTIR获得的两种重楼红外光谱信息进行对比，分析使用FTIR与UV低级数据融合技术的分类效果，为准确建立重楼产地鉴别模型及选择优质产地提供依据。

1 实验部分

1.1 材料来源

在云南省怒江州、西双版纳傣族自治州、昆明市、文山州及贵州省兴义市、安顺市共采集156株重楼根茎，经云南中医学院张庆芝教授鉴定为云南重楼P.polyphyllaSmith var.yunnanensis。将重楼样品新鲜根茎洗净阴干，切片置于50 ℃烘箱内烘干，粉碎，过100目筛，自封袋密封保存。

1.2 仪器与试剂

傅立叶变换红外光谱仪配备ATR附件(ZnSe晶体材料)及DTGS检测器(美国Perkin Elmer公司)；UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；YP-2压片机(上海山岳科学仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；CH936B除湿机(森井电气公司)；DFY-50型中药材粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；电子天平(梅特勒·托利多仪器有限公司)；超声波清洗仪(上海声源超声波仪器设备有限公司)。

超纯水系统；甲醇(分析纯)；溴化钾(分析纯)。

1.3 FTIR、ATR-FTIR及UV采集参数条件

在保持室温且干燥环境下，精确称取1.0 mg重楼样品与100 mg KBr粉末，于玛瑙研钵内混匀并研磨后压成透明薄片，扫描(背景扫描采用100 mg KBr粉末压成的透明薄片)。光谱采集范围400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描累积量16次，每个编号样品重复3次，取FTIR平均光谱图。

保持房间恒温干燥，每次扫描前进行空气的背景扫描，取重楼样品粉末于干燥且洁净的硒化锌晶体材料上进行光谱扫描，累积扫描16次，压力保持在130～140 Pa之间，光谱采集范围650～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，单个样品重复3次，取ATR-FTIR平均光谱图。

精确称取0.1 g重楼样品于试管中，加入10 mL甲醇溶解，超声40 min后过滤，收集滤液于干净试管内，紫外仪器预热1 h后进行光谱采集，采用石英比色皿扫描空白甲醇，以减少基线漂移，采集重楼样品UV图谱，扫描间隔1 nm，单个样品重复3次，取平均UV光谱图。

1.4 数据处理

重楼样品的原始FTIR及ATR-FTIR光谱利用OMNIC软件转化吸光度；以UVProbe软件对原始UV进行平滑等处理;SIMCA-P+13.0软件对UV、FTIR、ATR-FTIR及经ATR校正的ATR-FTIR(ATR-FTIR-A)光谱数据分别进行不同预处理，如一阶导数(First derivatives,FD)、二阶导数(Second derivatives,SD)、标准正态变量(Standard normal variables,SNV)，以消除无关干扰(高频随机噪音、光散射、基线漂移、浓度不均等)，使模型准确度增强，预测效果提升[18-20]。采用Kennard-Stone算法筛选2/3训练集与1/3预测集，通过SIMCA-P+13.0、MATLAB R2014a软件分别建立PLS-DA及SVM判别模型。参考模型所得训练集分类正确率(AT)、预测集分类正确率(AP)、校正均方根误差(Root mean square error of estimation,RMSEE)、交叉验证均方差(Root mean square error of cross-validation,RMSECV)、预测均方根误差(Root mean square error of prediction,RMSEP)等相关参数，选取最佳预处理方式(表1)。将不同单光谱信息直接串联融合，建立低级数据融合的两种判别模型，进而比较不同模型的稳定性及对不同产地重楼的分类效果。

表1 不同光谱不同预处理方式下的模型结果对比Table 1 Comparison of models results with multiple spectra of different pretreatment combinations

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析

图1B为二阶导数光谱图，如图所示，ATR-FTIR及ATR-FTIR-A在4 000～3 600 cm-1及2 500～1 700 cm-1范围内，C—H及C—O的伸缩振动等吸收较FTIR明显。二阶导数谱图比原始谱图显示出更多细小信息，3 600～2 500 cm-1及1 700～650 cm-1范围内的一些特征峰峰形更明显。可以发现，ATR-FTIR与FTIR信息基本吻合；ATR-FTIR对样品无预处理操作，简化了操作过程，在样品检测后还可进行回收，为重楼FTIR分析提供了比KBr压片检测法更高效简单的技术。

图2为不同产地重楼的FTIR、ATR-FTIR及ATR-FTIR-A谱图。6个产地重楼样品峰形及峰位类似，吸光度略有差异。KBr压片法与ATR测得的FTIR数据显示，各个产地重楼的吸光度强度有所不同，其中文山州样品吸光度在使用传统FTIR方法时比其他产地低，使用ATR-FTIR则为最高，可能原因是FTIR需研磨样品至极细粉，而ATR-FTIR直接测定样品获得信息，导致吸光度大小产生差异。由于各产地间其他细微差异从图中难以直接分辨，故需进一步利用红外光谱数据建立判别模型进行分析。

2.2 紫外光谱分析

图3A为所有重楼样品的原始UV平均图谱，其主要吸收峰在200～370 nm范围内，其中207 nm处可能是薯蓣皂苷或溶剂甲醇的吸收峰，222 nm可能对应重楼皂苷Ⅶ的吸收，重楼皂苷C大致对应283 nm处的吸收峰。Tatar等[24]利用UV测定缬沙坦含量时发现，与原始UV吸收和其它阶导数光谱相比，二阶导数谱具有较好的信噪比以及更清晰明确的峰值。图3B为经二阶导数处理的重楼紫外光谱图，有效提高了谱图分辨率，除原始光谱存在的特征吸收峰，还明显存在213、238、249、275、288、303 nm等处的吸收峰。

图2 不同产地重楼的红外原始平均光谱图Fig.2 Original Fourier transform infrared average spectra of P.polyphylla in different areasA.FTIR;B.ATR-FTIR;C.ATR-FTIR-A

2.3 偏最小二乘判别分析

PLS-DA是目前使用较多的基于偏最小二乘回归的多元统计分类方法之一，该法是将数据转换为一组线性潜在变量并用于分类变量预测，即包括x、y两个变量，每一组x观测值都对应一个y变量，用于确定观测数据所属类别[25]。R2是认定模型与数据匹配程度的一种度量标准，效果越好的模型的R2越接近于1。但仅凭这一项标准衡量模型效果略显不足，因此还需要观察Q2。Q2是代表交叉验证所得百分比的一项拟合参数，Q2>0.5时表示模型具有良好的预测能力。RMSEE、RMSECV及RMSEP参数用来评价模型效果，其数值越小表示模型越稳定，效果越好[26]。AT与AP分别表示训练集与预测集的分类正确率，数值越大正确率越高。

4种最佳预处理UV、FTIR、ATR-FTIR、ATR-FTIR-A单光谱及不同红外光谱与UV低级数据融合的PLS-DA模型参数如表2所示。就单一光谱而言，经过ATR校正处理的ATR-FTIR模型效果最佳，AT与AP也都达到100.00%。红外光谱与UV低级数据融合模型鉴别精度较相应单一红外光谱均有所提高。就ATR-FTIR-A-UV模型而言，其预测正确率与ATR-FTIR-A同为100%，但ATR-FTIR-A-UV的R2、Q2值更接近于1，RMSEE、RMSECV、RMSEP值也均有所减小，故ATR-FTIR-A与UV的低级数据融合模型更可靠。通过比较模型参数值发现，ATR-FTIR-A的PLS-DA模型各参数均好于FTIR-UV模型，即前者分类效果更好。

表2 不同光谱PLS-DA模型参数值Table 2 The model parameters of PLS-DA models with different spectra

2.4 支持向量机判别分析

支持向量机(SVM)是一种有监督的分类化学计量工具，通过最大化分类超平面和训练集最接近样本的距离，搜索不同数据类别之间最优分离超平面[27]。SVM包含两个参数，c作为一个惩罚参数，可控制SVM泛化能力，减小过拟合现象；而核函数参数g与模型的稳定程度有关。SVM模型不受异常值的影响，对控制样本数量要求不严格[25]。

表3为不同单一光谱与低级数据融合建立SVM模型所得特征参数值，Bestc、Bestg分别代表模型最佳惩罚参数与核函数参数。UV模型的AT与AP分别为62.50%和73.08%，相差10.00%以上，FTIR、ATR-FTIR及ATR-FTIR-A单光谱的AT与AP相差均在5.00%以内，表明利用UV数据建立的SVM模型可靠性较差，ATR-FTIR-A在单光谱SVM模型中鉴别精度最高，效果最佳。不同红外光谱与UV相融合建立的SVM模型的正确率均高于相应单一红外光谱SVM模型，c、g值也处于正常范围内，模型稳定，说明数据融合效果优于单光谱。FTIR-UV模型AT与AP均为90.38%，ATR-FTIR-A分别为97.12%和100.00%，ATR-FTIR-A-UV融合模型正确率更高，达到99.04%及100.00%，故ATR-FTIR-A的SVM分类模型可用于有效区分不同来源重楼，ATR-FTIR-A-UV鉴别精度更高，体现了数据融合的准确性与有效性。

表3 不同光谱SVM模型参数值Table 3 The model parameters of SVM models with different spectra

图4A、C分别为利用FTIR-UV、ATR-FTIR-A-UV低级融合数据建立SVM分类模型时筛选Bestc及Bestg所得的最优分离超平面图，图4B、D分别为FTIR-UV及ATR-FTIR-A-UV的SVM模型预测集实际与预测分类结果图。图4A所得超平面平滑程度较图4C差，正确率也相应偏低。图4B中有5个预测集样本分类错误：第2类中有1个样本错分到第4类，第4类中有1个样本错分在第2类，以及有3个样本错分到第6类，而图4D全部分类正确，表明ATR-FTIR-A-UV的SVM分类模型效果明显好于FTIR-UV。

3 结论

ATR-FTIR技术省略了样品预处理过程，无损操作，样品检测后可回收，为重楼提供了简便准确的红外分析技术。该技术简化了重楼分类模型的建立过程，极大提升了鉴别效果。直接利用ATR-FTIR-A单一光谱建立的PLS-DA或SVM产地鉴别模型分类正确率高，在实际生产中高效简便；若进一步采用ATR-FTIR-A-UV低级数据融合建立模型可加强模型的稳定性。