汤 涛，张昌朋，吴 珉，许振岚，何红梅，张春荣，赵学平

(浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所/省部共建国家重点实验室培育基地“浙江省植物有害生物防控重点实验室”/农业部农药残留检测重点实验室，浙江 杭州 310021)

乙烯利(Ethephon)又名乙烯磷,是一种人工合成的植物生长调节激素，可以释放出乙烯，具有促进果实成熟、调节性别转化等作用，常作为脱叶剂应用于棉花作物[1-2]。已有的研究表明乙烯利具有神经毒性，对皮肤、眼睛、黏膜有刺激作用，食用过量乙烯利可加速消化道衰老，造成消化道溃疡，影响大脑和肾脏健康，对动物免疫和生殖系统也有一定的损害[3-4]。棉籽油具有天然的抗氧化能力，是我国棉花主产区居民的主要食用植物油之一，年产量居我国食用植物油的第四位，同时棉籽经脱壳提油后所得的棉籽粕中，蛋白质含量可达40%～50%，在质量上近似豆类蛋白，是畜牧产业发展的优质饲料[5-7]。乙烯利的每日允许摄入量(Acceptable daily intake,ADI)为0.05 mg/kg bw，我国规定其在棉籽中的最大残留限量(Maximum residue limit,MRL)为2 mg/kg[8]。目前已报道的关于乙烯利的检测方法主要有离子色谱法[9-12]、气相色谱法[13-14]和液相色谱-串联质谱法[15-18]。其中，离子色谱法为半定性分析，很难对乙烯利残留进行准确的定量检测；气相色谱法一般需要进行衍生化，或使其在碱性条件下加热分解出乙烯，再结合顶空进样方式进行检测，该方法的样品前处理步骤多、操作复杂，且定量的准确性易受衍生化产物的稳定性或释放出乙烯的量所限制。超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)具有灵敏度高、选择性好、特异性强和分析速度快的优点，Xie等[16]采用LC-MS/MS方法分析了乙烯利、噻苯隆和敌草隆等植物生长调节剂在棉花中的残留量，测得乙烯利在棉花中的检测定量限(LOQ)为0.04 mg/kg，Su等[17]采用QuEChERS结合LC-MS/MS方法检测了多种果蔬中的乙烯利残留量，样品经石墨化碳(GCB)和N-丙基乙二胺(PSA)净化后检测，测得乙烯利在黄瓜等果树中的LOQ为1.2～2.2 mg/kg。

本研究以棉籽、棉叶和土壤为供试材料，采用固相萃取法结合UPLC-MS/MS技术，拟开发灵敏度更高的乙烯利分析方法，通过对实际样品的检测来验证方法的可靠性，所建方法有望用于棉籽中乙烯利残留的抽检监测及该药的残留登记试验。

1 实验部分

1.1 仪器与试材

UPLC-MS/MS-8050超高效液相色谱-串联质谱联用仪(日本岛津公司)；SPS402F电子天平(精确至 0.01 g，奥豪斯公司)；AB135-S 电子天平(精确至0.1 mg，梅特勒-托利多公司)；TYZD-IIA振荡器(天仪电子仪器有限公司)；VTX-3000L涡旋仪(杭州雷琪试验器材公司)；12通道固相萃取装置(美国Supelco公司)；3-18k高速离心机(德国Sigma公司)；R-210旋转蒸发仪及V-700真空泵(瑞士Buchi公司)。

乙烯利标准品(纯度99.8%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)；75%乙烯利水剂(绍兴市东湖生化有限公司)；Oasis MAX(3 cc,60 mg)、Oasis HLB(3 cc,60 mg)和Oasis WAX(3 cc,60 mg)固相萃取净化柱(美国Waters公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，德国默克公司)；甲酸、氨水(色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；实验用水均为经Milli-Q 超纯水器纯化的超纯水。

1.2 标准溶液的配制

精确称取乙烯利标准品0.01 g(精确至0.1 mg)，以甲醇溶解并定容至50 mL，配制194 mg/L乙烯利标准储备溶液。用甲醇稀释至97 mg/L，再分别用甲醇、棉籽、棉叶和土壤3种不同空白基质提取液逐级稀释，配制成0.02、0.097、0.194、0.97、1.94 mg/L乙烯利系列浓度标准工作溶液。

1.3 样品前处理

提取：准确称取各类样品(棉籽、棉叶、土壤) 5 g于50 mL离心管中，加入25 mL甲醇-1%甲酸(70∶30，体积比)提取液，涡旋提取2 min，4 000 r/min条件下离心5 min。移出5 mL提取液待净化。

净化：Oasis MAX(3 cc,60 mg)固相萃取小柱经3 mL甲醇和3 mL水活化后，将5 mL提取液上样并用3 mL甲醇淋洗，弃去淋出液，用6 mL含2%甲酸的甲醇洗脱后，洗脱液在40 ℃条件下旋转浓缩并氮吹至干，用流动相定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，待测。

1.4 仪器检测条件

色谱条件：色谱柱为Waters CORTECS HILIC(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)超高效液相色谱柱，流动相为0.01%氨水溶液-乙腈(80∶20，体积比)，流速0.2 mL/min，柱温40 ℃，进样体积2 μL。

质谱条件：电离方式为ESI-，采用多反应监测(MRM)模式；Interface volta为4 kV，雾化气流速为3.0 L/min，干燥气流速为10.0 L/min，加热气流速为10.0 L/min，Interface 温度为300 ℃，脱溶剂管温度为250 ℃，Heat Block温度为400 ℃；碰撞能量为-22 eV和-25 eV(碰撞气为Ar)，驻停时间为100 ms，母离子m/z143，子离子m/z107(定量)，子离子m/z79(定性)。

1.5 实际样品的制备

2017 年在浙江和山东 2 地对棉花田施用75%乙烯利水剂，小区面积30 m2，剂量为1 687.5 g a.i./ha，处理重复3次，另设清水空白对照。施药后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d采集棉叶和土壤样品，最后一次同时采集棉籽样品，采集的样品切碎、研磨、混匀后贮存于-20 ℃冰柜中待测。

图1 不同提取溶剂对乙烯利的提取效率Fig.1 Extraction efficiencies of ethephon with different solvents

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

合适的提取溶剂是保证目标组分回收率的关键，通常情况下，提取溶剂的选取需要依据目标组分的物化性质及样品的类型来确定[19]。常用于农药残留检测的提取剂主要有乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯等[20]。根据乙烯利的溶解度特性和样品的性质，在0.194 mg/kg加标水平条件下，乙腈、甲醇和甲醇-1%甲酸(70∶30，体积比)混合提取液对3种基质的提取效率见图1。结果表明，乙腈对3种基质中乙烯利的提取效率最低(17%～26%)，Xie等[16]采用乙腈提取棉花样品时未检出乙烯利，说明乙腈不适于作为乙烯利在多数样品中的提取溶剂；用甲醇作提取溶剂时，土壤中乙烯利的提取效率为75%，基本满足要求，但对棉籽和棉叶中乙烯利的提取效率较差(分别为57%和48%)；以甲醇-1%甲酸(70∶30)二元混合提取液作为提取溶剂时，乙烯利在3种基质中的提取效率较高(85%～92%)，且共提出的杂质较少。因此，本实验选用甲醇-1%甲酸(70∶30)混合提取液作为3种不同基质中乙烯利残留的提取溶剂。

2.2 SPE小柱的选择

乙烯利是带有磷酸根并具有强极性的二元酸(pKa=2.5和7.2)[18]，根据乙烯利的物化特性，选取并比较了适用于酸碱和中性农药的Oasis HLB、强酸性农药的Oasis WAX和酸性农药的Oasis MAX 3种净化柱对棉籽、棉叶及土壤基质中乙烯利的净化效果，以含2%甲酸的甲醇作为洗脱剂。结果表明，在0.194 mg/kg 加标水平下，Oasis MAX小柱对3种基质的净化效果最好，且回收率较高(82%～91%)；Oasis HLB小柱对3种基质的净化效果也较好，但乙烯利的回收率较低(65%～72%)；而Oasis WAX小柱对乙烯利的回收率最低(43%～50%)。这可能与Oasis MAX小柱的填料性质有关，其填料为弱阴离子吸附剂(pKa=6.0)。因此本研究选用Oasis MAX作为不同基质提取液的净化小柱。

2.3 流动相的选择

在棉籽中添加0.194 mg/kg乙烯利水平下，按照优化的样品前处理方法，分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.01%氨水和乙腈-0.05%氨水作为流动相体系时对乙烯利的分离效果和响应强度。结果表明，以乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸作为流动相时，乙烯利的峰形差，且响应值很低(图2A和图2B)；以乙腈-0.01%氨水作为流动相时，响应值较好，但峰形拖尾，且乙烯利的保留时间漂移(图2C)；以乙腈-0.05%氨水作为流动相时，乙烯利峰形和响应值均较好，且基线平稳，保留时间合适(图2D)。综合考虑，最终选择乙腈-0.05%氨水作为乙烯利检测分析的流动相。

2.4 质谱条件的优化

使用1.94 mg/L的乙烯利标准溶液，在连接两通的条件下，流动相组成为0.01%氨水溶液和乙腈(50∶50，体积比)，流速0.2 mL/min，进样体积1 μL，分别用电喷雾电离正离子模式( ESI+)和电喷雾电离负离子模式( ESI-)进行母离子全扫描，扫描范围m/z为100～500。结果表明：在负离子模式下(ESI-)，乙烯利的电离效果最佳，信号强度高于正离子模式，获得m/z143的[M-H]-准分子离子峰。对乙烯利的[M-H]-进行二级质谱扫描得到碎片离子，选择m/z143/107 和m/z143/79分别为定量和定性离子对，当碰撞能量为 -22 eV 时，碎片离子m/z107的响应值大于m/z79，因此选择m/z107作为定量离子。

图3 乙烯利在溶剂和各基质提取液中的标准曲线Fig.3 Standard curves of ethephon in solvent and matrix-matched extracts

2.5 基质效应分析

采用液相色谱-串联质谱检测农药残留时，基质效应(Matrix effect，ME)是经常遇到的问题，在样品提取净化过程中共流出的杂质可增强或抑制目标组分的离子化效率，从而导致检测误差[21]。一般情况下，采用基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率比值增加或减少的百分比来评价基质效应，计算公式为ME=(a-b)/a×100%(a和b分别为基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率)。当|ME|<20%时表示基质效应较小，可采用溶剂标定；当20%≤|ME|≤50%时表示基质效应较大，应考虑采用基质标定；当|ME|>50%时表示基质效应很强，需继续优化样品前处理方法以降低基质效应[22]。本研究采用溶剂和各基质提取净化液分别配制乙烯利的系列标准工作液，在已确定的仪器条件下进样，并绘制标准曲线评价基质效应。结果表明，乙烯利在0.02～1.94 mg/L范围内，在溶剂及各基质提取液中的线性关系良好(图3)，r2≥0.996 3，计算得到乙烯利在棉籽、棉叶和土壤中的基质效应系数分别为13.4%、7.2%和-17.4%，各基质效应系数的绝对值均小于20%，因此本研究采用溶剂标匹配外标法对乙烯利进行准确定量。

2.6 线性范围、检出限与定量下限

在优化条件下，考察乙烯利的线性关系，结果显示，乙烯利的峰面积与其质量浓度在0.02～1.94 mg/L范围内呈良好的线性关系，其标准曲线方程为：y=2.79×106x+2.11×104(r2=0.998 3)。以最低添加水平的信噪比S/N≥3作为方法的检出限(LOD)，S/N≥10作为方法的定量下限(LOQ)，测得乙烯利在棉籽、棉叶和土壤3种基质中的LOD和LOQ分别为0.01 mg/kg和0.02 mg/kg。

表1 乙烯利在棉籽、棉叶和土壤空白样品中的加标回收率及相对标准偏差(n=5)Table 1 Recoveries and RSDs of ethephon in cotton seed,cotton leaf and soil(n=5)

2.7 回收率与相对标准偏差

在优化条件下，采用棉籽、棉叶和土壤空白样品进行加标回收实验，每种基质分别加标0.02、0.194和3.88 mg/kg 3个水平，每个加标水平重复5次。结果表明：乙烯利在3种基质中的回收率为78.3%～95.1%，RSD为1.9%～5.2%，回收率和相对标准偏差均符合NY/T788-2004《农药残留试验准则》的要求[23]。

2.8 方法应用

采用本文建立的方法对浙江省和山东省2个试验点施用乙烯利的棉田样品进行检测(表2)。结果表明：在2地的棉籽样品中均未检出乙烯利；浙江点的棉叶中乙烯利的检出范围为0.22～31 mg/kg，消解规律符合一级动力学方程，Ct=22.028 3e-0.170 1t，降解半衰期为4.1 d；山东点的棉叶中乙烯利的检出范围为0.23～22 mg/kg，消解规律符合一级动力学方程，Ct=19.577 6e-0.228 0t，降解半衰期为3.0 d；浙江点的土壤中乙烯利检出范围为0.17～8.9 mg/kg，消解动力学方程为Ct=8.270 6e-0.125 2t，消解半衰期为5.5 d；山东点的土壤中乙烯利检出范围为0.19～4.0 mg/kg，消解动力学方程为Ct=3.484 1e-0.134 2t，消解半衰期为5.2 d。从检测结果看，乙烯利在棉叶和土壤中的消解速率较快，施药后28 d时其残留量已很低。

表2 乙烯利在棉叶和土壤中的残留量Table 2 Content of ethephon residues in cotton leaf and soil w/(mg·kg-1)

3 结 论

本研究采用固相萃取(Oasis MAX净化柱)样品前处理方法，结合超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱技术，以及负离子和多反应监测模式，建立了棉籽、棉叶和土壤中乙烯利残留的检测方法。在优化条件下，乙烯利在棉籽、棉叶和土壤中的回收率为 78.3%～95.1%，RSD为 1.9%～5.2%，3种基质中的LOQ均为 0.02 mg/kg，方法的灵敏度符合农药残留检测要求。通过对实际样品的检测，表明所建方法具有操作简单、提取试剂毒性较低、重复性好、灵敏度高等特点，适用于棉籽中乙烯利残留的抽检监测及该药的残留登记试验。