陈锦东　华薇　王玉

【摘 要】L-缬氨酸（L-val）为支链氨基酸中的一种，是合成蛋白质的素材，也可以作为生物体的能源和前体，目前主要用于氨基酸输液和氨基酸口服液。L-缬氨酸在国外用途很广，用它作原料合成N-乙酰缬氨酸具有抗癌功能，本文对其柱前衍生HPLC分析方法进行了探讨。

【关键词】L-缬氨酸;柱前衍生HPLC;分析方法

中图分类号： Q789文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）36-0090-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.36.041

0 引言

L-缬氨酸（L-val）和L-异亮氨酸，L-亮氨酸统称为支链氨基酸，目前氨基酸的分析方法有分光光度法、色谱法和电化学法等。其中，分光光度法一般适合于检测在紫外区有吸收的氨基酸，电化学法仅可检测具有电活性的氨基酸。色谱法有离子色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法和毛细管电泳法等，其中离子色谱法和高效液相色谱法是应用最多的方法[1]。

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，可以分为直接分析、柱前衍生化、柱后衍生化等种类。与其他两种方法相比，柱前衍生化具有所用设备简单，方法通用性、稳定性好等特点，已经得到较大的发展[2]。

衍生化是一种利用化学变换把化合物转化成类似化学结构的物质。本文探讨了L-缬氨酸的柱前衍生HPLC分析过程，以获得稳定可靠的分析方法。

1 实验方案

1.1 溶液配制

准确称取0.5g2，4-二硝基氟苯（DNFB），用乙醇定容至100mL，現配现用。

衍生化缓冲溶液的配制;准确称取4.2g碳酸氢钠加入至100mL容量瓶中，用高纯水定容并摇匀备用。定容缓冲溶液的配制;准确称取3.4g磷酸二氢钾，加高纯水溶解，转移至500mL容量瓶，加145.5mL0.1moL/L氢氧化钠混合，用高纯水定容至刻度。

流动相A的配制;乙腈。

流动相B的配制：

准确称取4.1g醋酸钠，加约900mL高纯水溶解，用醋酸调节pH至6.4，加N，N-二甲基甲酰胺10mL，转移至1000mL容量瓶中，用高纯水定容至刻度。

L-缬氨酸样品溶液的配制

已知在生产L-缬氨酸过程中会产生的杂氨酸有丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，其中亮氨酸和异亮氨酸最难分离，只要最难分离对达到分离，就可视为全部物质已经分离。称取L-缬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸标样各50mg，混合溶解，用高纯水定容至25mL。

1.2 流动相梯度条件的选择

设初始梯度为0min 流动相A：B=5：95，30min结束梯度为流动相A：B=95：5，做出色谱图，再将难分离的峰的洗脱时间延长，反复测定，找出最佳梯度。

色谱柱：THERMO C18柱;柱温：35℃;进样量：20μL;流动相流速：1.0mL/min

检测波长：UV360nm

1.2.1 衍生化条件的选择

取5个棕色容量瓶，分别加入0.15mL的L-缬氨酸样品溶液，1mL缓冲溶液，摇匀后再加入1mL衍生试剂，摇匀，将容量瓶置于40℃水浴中暗处恒温加热，分别在15min，30min，45min，60min，75min时取出1个容量瓶，放置10min待溶液冷至室温后，加入定容缓冲液至刻度并摇匀，放置15min后开始进行色谱分离。

1.2.2 精密度实验

取5个棕色容量瓶，加入1.5mLL-缬氨酸样品溶液，1mL缓冲溶液，摇匀后加入1mL衍生化试剂，摇匀，将容量瓶置于50℃水浴中暗处恒温加热，在30min后取出，放置待溶液冷却至室温后，加入定容缓冲液至刻度并摇匀，放置15min后开始按3.3.4色谱条件进行色谱分离。

1.2.3 加标回收实验

称取L-缬氨酸标样，丙氨酸标样，亮氨酸标样，异亮氨酸标样各10mg，混合溶解，用高纯水定容至10mL，取5个棕色容量瓶，加入1.5mLL-缬氨酸样品溶液，再分别加入0.05mL，0.1mL，0.15mL，0.2mL，0.25mL混合标液，1mL缓冲溶液，摇匀后加入1mL衍生化试剂，摇匀，将容量瓶置于50℃水浴中暗处恒温加热，在30min后取出，放置待溶液冷却至室温后，加入定容缓冲液至刻度并摇匀，放置15min后开始按3.3.4色谱条件进行色谱分离。

2 结果与讨论

2.1 流动相梯度条件的选择

对比甲醇与乙腈的分离效果，甲醇得到的峰型较差，部分组分没有完全分离，乙腈分离效果稍好，各峰基线分离效果好。

由于L-缬氨酸样品中杂氨酸较多，氨基酸的极性不同，用同一梯度分离多种氨基酸，保留时间相差很大，导致分析时间过长，要同时分析几种氨基酸的含量，需要进行梯度洗脱，在保证分离效果的情况下进行梯度洗脱减少分析时间。

梯度洗脱又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。

流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。

图1 梯度洗脱示意图

第一次对所测物质进行梯度设计时，由于不知道各个物质洗脱时流动相的比例，可以在一段时间内流动相中有机相由低比例升到高比例进行洗脱，然后再对有重峰，出现拖尾，分析时间过长等问题进行解决，逐步优化，最终确定流动相的梯度。

通过实验可以看出，丙氨酸，L-缬氨酸的峰能够很好的分离，且峰型尖锐，但亮氨酸和异亮氨酸色谱峰重叠，不能实现有效分离，且它们的保留时间较长，需增加这一梯度的洗脱时间，另外10min前没有出峰，25min后不再出峰，可以将这两段的时间缩短。

通过实验可看出，亮氨酸和异亮氨酸基本分离，但保留时间在12min到20min之间没有物质出峰，可以减少这一段分析时间，以提高分析效率。

通过实验可看出，各个物质分离效果好，峰型尖锐，对称性良好，且分析时间较短，分析效率较高。因此HPLC确定的色谱条件为：

色谱柱：THERMO C18柱（250×4.6mm，5μm）;柱温：35℃;进样量：20μL;流动相流速：1.0mL/min;检测波长：UV360nm。

2.2 衍生化条件的选择

高效液相色谱的化学衍生法是指在一定条件下利用某种试剂（通称化学衍生试剂或标记试剂）与样品组份进行化学反应，反应的产物有利于色谱检测或分离。

本实验采用柱前衍生化进行L-缬氨酸的分析研究，具体方案：取5个棕色容量瓶，分别加入0.15mL的L-缬氨酸样品溶液，1mL缓冲溶液，摇匀后再加入1mL衍生试剂，摇匀，将容量瓶置于40℃水浴中暗处恒温加热，分别在15min，30min，45min，60min，75min時取出1个容量瓶，放置10min待溶液冷至室温后，加入定容缓冲液至刻度并摇匀，放置15min后开始进行色谱分离。用此方法测定50℃，60℃，70℃时的峰面积。

以衍生化时间为横坐标，峰面积为纵坐标，做出各个氨基酸在各温度下的折线图，找出最佳衍生化温度和衍生化时间。

从上述图中可以看出，一开始衍生化产率较低，随着衍生化时间的增加，衍生化产率升高，峰面积先上升再趋于稳定，最佳衍生化时间为30min;随着温度的升高，峰面积先增大，随着温度的上升，衍生物稳定性较差，峰面积略有下降，最佳衍生化温度为50℃，所以衍生化温度为50℃，衍生化时间为30min时各个氨基酸的峰面积达到最大值，检测效果最好。因此，确定衍生化条件为：取0.15mL氨基酸样品于10mL棕色容量瓶中，加入配制好的衍生化缓冲液1mL，摇匀后再加入衍生化试剂1mL，摇匀，将容量瓶置于50℃水浴中暗处加热30min后取出，放置待溶液冷却至室温后，加入定容缓冲液至刻度并摇匀，放置15min后开始进行色谱分离。

3 结语

本实验采用的是高效液相色谱仪，HPLC法具有方法灵活多样、灵敏度高、分析时间较短等优点，已被广泛应用于各个领域氨基酸的检测。用柱前衍生化HPLC法测定发酵液中L-缬氨酸的含量灵活多样灵敏度高、分析时间段、精密度高。采用C18柱，梯度洗脱的分离模式，UV检测，经衍生化试剂衍生化进行检测。用DNFB作为衍生化试剂，价格低，衍生物稳定，适合于定量测定。

实验系统的考察了流动相条件，衍生化条件，线性关系，精密度以及加标回收等。最佳实验条件为：色谱柱：THERMO C18柱 （250×4.6mm，5μm），柱温：35℃，进样量：20μL，流动相流速：1.0mL/min，检测波长：UV360nm，流动相梯度条件：25%A+75%B（0min），40%A+60%B（10min），40%A+60%B（13min），65%A+35%B（15min），65%A+35%B（17min），25%A+75%B（20min）。衍生温度50℃，衍生时间30min。

本文选定的是用柱前衍生化HPLC法测定L-缬氨酸的含量，结果表明在适宜的色谱条件下各个氨基酸分离良好，线性实验中，线性相关系数良好，重现性好，样品测定结果准确，适合用于L-缬氨酸的检测分析。

【参考文献】

[1]李晓华，陈宁，张克旭.化学比色法测定发酵液中L-缬氨酸的研究[J].氨基酸和生物资源，2003，25（4）：55～57.

[2]程勇，陈玲，邓小春.柱前衍生HPLC法测定烟叶种20种游离氨基酸含量[J].烟草化学，2010，8.