王玉琴 双 全

(1. 乌兰察布医学高等专科学校，内蒙古 乌兰察布 012000；2. 内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特 010018)

山桐子别名水冬瓜、水冬桐、椅树、椅桐、斗霜红，为大风子科、山桐子属落叶乔木，分布于中国、日本、朝鲜与俄罗斯远东地区，在中国主要产于四川盆周山地、重庆、云南、贵州、陕西南部、甘肃南部、湖北、湖南、江西、浙江、福建和台湾地区[1-2]。

山桐子整果平均含油率为36.71%，不饱和脂肪酸含量高达80%，其中亚油酸含量高达68%～71%，与红花籽油相当，比芝麻油、山茶油、花生油和橄榄油的含量都高，且维生素E含量高，是一种优质的木本食用油脂[3-4]。虽然在山桐子主产区食用山桐子油已有上百年历史，但是山桐子油工业化生产却鲜有报道，吴发旺等[5]曾采用冷榨法制取山桐子油，饼渣残油高；旷春桃等[6]曾采用超临界流体萃取山桐子油，提取率虽高，但成本高，不易投产。水酶法提取的植物油品质高，对环境污染少，符合安全、营养、绿色的要求。目前已被应用于菜籽[7]、玉米胚[8]、油茶籽[9]等油料作物的提取，并取得了良好的效果[10]。但目前中国尚未有水酶法提取山桐子油的相关文献报道。

本试验拟对水酶法提取山桐子油工艺条件进行优化，并对提取得到的油脂进行相关指标检测，以期为山桐子高效生产加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

山桐子：购于四川广元市；

维生素E标准品：HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司；

水解蛋白酶Alcalase2.4L：2.4 AU/g，丹麦诺维信公司；

果胶酶(10 000 U/g)、纤维素酶(10 000 U/g)、中性蛋白酶(50 000 U/g)：阿拉丁试剂(上海)有限公司；

各种脂肪酸甲酯标准品：美国Sigma公司；

其他试剂均为分析纯；

水为蒸馏水；

精密数显恒温水浴锅：J-HH-4A型，冠森生物科技(上海)有限公司；

实验室搅拌机：RW20型，艾卡(广州)仪器设备有限公司；

小型粉碎机：FW-100型，天津市泰斯特仪器有限公司；

pH计：DELTA 320型，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司；

分析天平：Practum224-1CN型，岛津(上海)实验器材有限公司；

离心机：L-550型，湖南湘仪离心机仪器有限公司；

高效液相色谱仪：E2695型，美国沃特世科技有限公司；

气相色谱仪：7890B型，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 山桐子及山桐子油相关指标检测方法

(1) 山桐子水分测定：按GB 5009.3—2016的第一法执行。

(2) 粗脂肪测定：按GB 5009.6—2016执行。

(3) 蛋白质测定：按GB 5009.5—2016执行。

(4) 淀粉测定：按GB 5009.9—2016执行。

(5) 山桐子油水分测定：按GB 5009.236—2016执行。

(6) 酸价测定：按GB 5009.229—2016执行。

(7) 过氧化值测定：按GB 5009.227—2016执行。

(8) 色泽测定：按GB/T 22460—2008执行。

(9) 维生素E测定：按GB 5009.82—2016执行。

1.2.2 脂肪酸组成分析

(1) 样品制备：按GB 5009.168—2016执行。

(2) 气相色谱条件：气相色谱柱为DB-wax毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，FID检测器，采用程序升温, 初始温度180 ℃，保持0.5 min，以5 ℃/min升至200 ℃，然后以15 ℃/min 升至240 ℃，保持时间5 min；再以2 ℃/min升至242 ℃，保持2 min。

1.2.3 山桐子油水酶法提取工艺 将山桐子在适当温度下进行蒸炒，然后准确称取粉碎过40目筛的山桐子粉200.0 g，加1 000.0 g的热水(约90 ℃)在90 ℃水浴下糊化40 min。淀粉糊化后，调节pH值和温度，参考文献[11]加入复合酶(水解蛋白酶Alcalase2.4L∶果胶酶∶纤维素酶质量比1∶1∶1)酶解后灭酶活，调节pH=7.00加入0.4%中性蛋白酶酶解破乳1 h。提取后在5 000 r/min离心20 min，吸取上层清油。提取率按式(1)计算：

(1)

式中：

X——提取率，%；

m——提取得到的油脂重量，g；

M——原料含油重量，g。

1.2.4 单因素试验

(1) 蒸炒温度：以蒸炒时间15 min，料液比1∶4 (g/mL)，酶解温度40 ℃，酶解时间4 h，复合酶用量1.5%和pH 6.0作为基本条件。考察不同蒸炒温度(90，110，130，150，170，190 ℃)对山桐子油提取率的影响。

(2) 蒸炒时间：以蒸炒温度130 ℃，料液比1∶4 (g/mL)，酶解温度40 ℃，酶解时间4 h，复合酶用量1.5%和pH 6.0作为基本条件。考察不同蒸炒时间(5，10，15，20，25 min)对山桐子油提取率的影响。

(3) 料液比：以蒸炒温度130 ℃，蒸炒时间15 min，酶解温度40 ℃，酶解时间4 h，复合酶用量1.5%和pH 6.0作为基本条件。考察不同料液比[1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8 (g/mL)]对山桐子油提取率的影响。

(4) 酶解温度：以蒸炒温度130 ℃，蒸炒时间15 min，料液比1∶4 (g/mL)，酶解时间4 h，复合酶用量1.5%和pH 6.0 作为基本条件。考察不同酶解温度(30，40，50，60，70 ℃)对山桐子油提取率的影响。

(5) 酶用量：以蒸炒温度130 ℃，蒸炒时间15 min，料液比1∶4 (g/mL)，酶解温度40 ℃，酶解时间4 h和pH 6.0作为基本条件。考察不同酶用量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)对山桐子油提取率的影响。

(6) pH：以蒸炒温度130 ℃，蒸炒时间15 min，料液比1∶4 (g/mL)，酶解温度40 ℃，酶解时间4 h和复合酶用量1.5% 作为基本条件。考察不同pH(4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0)对山桐子油提取率的影响。

(7) 酶解时间：以蒸炒温度130 ℃，蒸炒时间15 min，料液比1∶4 (g/mL)，酶解温度40 ℃，pH 6.0和复合酶用量1.5% 作为基本条件。考察不同酶解时间(1，2，3，4，5，6 h)对山桐子油提取率的影响。

1.2.5 正交试验 以蒸炒温度、蒸炒时间、酶解温度、料液比、酶解时间、pH值、复合酶用量为影响因素，采用七因素三水平正交试验进行优化[12]。

1.3 数据处理

利用正交设计助手II软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 山桐子主要成分分析

山桐子主要成分测定结果见表1。

由表1可知，山桐子脂肪含量(37.27±1.55)%，蛋白质含量(9.78±0.74)%，水分含量(9.88±0.68)%，淀粉含量(10.13±0.88)%。山桐子脂肪含量和淀粉含量稍低于油茶籽仁；蛋白质含量与油茶籽仁相当[13]。

2.2 单因素试验

2.2.1 蒸炒温度的确定 蒸炒温度对山桐子油提取率的影响如图1所示。

由图1可知，随着蒸炒温度的升高，提取率先呈上升趋势，但是当温度超过150 ℃时提取率急剧下降。原因可能是蒸炒破坏了山桐子细胞壁，促进油脂从细胞中溶解出来；但当温度继续升高时，山桐子中的蛋白质、淀粉等物质高度变性，反而阻止了油脂的溶出[13-14]。结合山桐子油提取率和品质因素，选定山桐子蒸炒温度为130～150 ℃。

表1 山桐子主要成分

图1 蒸炒温度对水酶法提取率的影响

Figure 1 Effect of roast temperature on the oil extraction efficiency by queous enzymatic method

2.2.2 蒸炒时间的确定 蒸炒时间对山桐子油提取率的影响如图2所示。

图2 蒸炒时间对水酶法提取率的影响

Figure 2 Effect of roast time on the oil extraction efficiency by queous enzymatic method

由图2可知，随着蒸炒时间的延长，提取率先呈上升趋势，但是当蒸炒时间超过15 min 时提取率急剧下降。原因可能是蒸炒破坏了山桐子细胞壁，促进油脂从细胞中溶解出来，但蒸炒过度，会使山桐子中的蛋白质、淀粉等物质高度变性，反而阻止了油脂的溶出[14-15]。结合山桐子油提取效率和品质因素，选定山桐子蒸炒时间为15 min。

2.2.3 料液比的确定 料液比对山桐子油提取率的影响如图3所示。

由图3可知，当料液比处于1∶3～1∶5 (g/mL)时，提取率随着溶剂增加而增大；但料液比达到1∶5 (g/mL)后，提取率反而有所下降。溶剂过少时，油脂不能被更多地挤压出来，且所得的浆渣黏度大，离心时内部的分散油滴不易游离至表面，出油效率低。溶剂过多，多余的水分易与部分油脂、浆渣混在一起，从而产生乳化作用而不易分离，与此同时，生成的浆渣稀薄，表面张力小，黏度低，浆渣与油脂不容易分离[16]。因此选择料液比为1∶5 (g/mL)为宜。

2.2.4 酶解温度的确定 酶解温度对山桐子油提取率的影响如图4所示。

图3 料液比对水酶法提取率的影响

Figure 3 Effect of solid-liquid ratio on the oil extraction efficiency by queous enzymatic method

图4 酶解温度对水酶法提取率的影响

Figure 4 Effect of enzymatic liquefaction temperature on the oil extraction efficiency by queous enzymatic method

由图4可知，当温度低于40 ℃时，提取率随温度升高而增加；温度超过50 ℃ 以后，由于酶活力降低或失活，导致山桐子油难以释放，提取率降低。为防止体系不乳化而有利于后期油脂分离，因此，酶解温度选择40～50 ℃。

2.2.5 酶用量的确定 酶用量对山桐子油提取率的影响如图5所示。

由图5可见，随复合酶用量的增加山桐子提取率逐渐提高，到1.5%后提取率提高趋缓，随着酶用量的增加，提取率提高不明显。考虑到工业生产的经济成本，选择复合酶用量1.5%为宜。

2.2.6 pH的确定 pH对山桐子提取率的影响如图6所示。

由图6可见，在pH 5.5～6.5时有较高的提取率，超过pH 7.0或较低的pH值提油率降低，是由于水解蛋白酶Alcalase2.4L、果胶酶和纤维素酶在此pH范围内有较高的酶活力，在较高或较低的pH下酶活力降低或失活。因此，选择pH 6.0左右为宜。

图5 酶用量对水酶法提取率的影响

Figure 5 Effect of enzyme dosag on the oil extraction efficiency by queous enzymatic method

图6 pH对水酶法提取率的影响

Figure 6 Effect of pH on the oil extraction efficiency by queous enzymatic method

2.2.7 酶解时间的确定 酶解时间对山桐子油提取率的影响如图7所示。

由图7 可知，随着时间的延长，提取率逐渐增加，但超过4 h 时增加趋缓；酶解时间超过5 h后， 提取率几乎不再增加。综合考虑各方面因素，酶解提取时间以4 h为宜。

图7 酶解时间对水酶法提取率的影响

Figure 7 Effect of enzymatic liquefaction time on the oil extraction efficiency by queous enzymatic method

2.3 正交试验

以蒸炒温度、蒸炒时间、酶解温度、料液比、酶解时间、pH值、复合酶用量为影响因素，采用L18(37)正交表进行优化设计，正交试验因素水平表见表2，试验方案与结果见表3。

表2 正交试验因素水平表

从表3得出，以提取率为响应指标，各因素影响程度依次为酶解时间>料液比>复合酶用量>蒸炒时间>酶解温度>pH>蒸炒温度，微波处理最佳工艺条件为蒸炒温度150 ℃、蒸炒时间15 min、酶解温度50 ℃、料液比1∶5 (g/mL)、酶解时间5 h、pH 6.0、复合酶用量2.0%。经6次平行实验验证，该条件下水酶法提取山桐子油的提取率可达(93.88±1.22)%。

2.4 山桐子油理化指标及主要营养成分

对最佳工艺条件提取得到的山桐子油进行理化指标检测，结果见表4，主要脂肪酸组成见表5。

由表4可知，水酶法提取的山桐子油除了透明度以外气味、滋味，色泽，酸值，过氧化值，水分及挥发物，苯并[a]芘等理化指标均符合GB 2716—2018《食品安全国家标准 植物油》标准的规定，只要经过简单的精密过滤即可食用。

表4 水酶法提取山桐子油理化指标

表5 主要脂肪酸组成

由表4、5可知，山桐子油不饱和脂肪酸含量高达82%，不仅富含亚油酸，其维生素E的含量也高达227.8 mg/kg，是一种优质的木本食用油脂。

3 结论

水酶法提取山桐子油的最佳工艺条件为：蒸炒温度150 ℃，蒸炒时间15 min，酶解温度50 ℃，料液比1∶5 (g/mL)，酶解时间5 h，pH 6.0，复合酶(水解蛋白酶Alcalase2.4L∶果胶酶∶纤维素酶质量比1∶1∶1)用量2.0%。该条件下水酶法提取山桐子油的提油率可达(93.88±1.22)%。

水酶法提取的山桐子毛油气味清香，酸值、过氧化值等理化指标均较好，无须精炼，只要经过简单的精密过滤即可食用。水酶法提取的山桐子脂肪酸组成中亚麻酸含量可达(68.94±0.87)%，且维生素E含量较高。

本研究证实水酶法从山桐子中提取山桐子油实现工艺生产是可行的，为山桐子油的提取提供方向；但未就山桐子不同来源以及生物酶种类和比例的筛选进行研究，后期需要进一步深入研究。