前列腺癌是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤，是前列腺腺泡细胞异常无序生长的结果。发病率在欧美地区较高，亚洲地区较低[1]。但是，随着经济水平和医疗水平的提高，我国的前列腺癌发病率也在逐年增长，加之我国人口老龄化的加剧，前列腺癌将成为男性生殖系统中最常见的恶性肿瘤。其发病率随着年龄的增长而增长，高峰年龄是70～80岁。发病早期不易被发现，通常确诊时病情已发展至中晚期，主要症状表现为尿血、尿痛及骨痛。目前，中晚期前列腺癌患者的主要治疗方法是内分泌治疗，但经过18～24个月的内分泌治疗后，都会最终进展为去势抵抗性前列腺癌[2-3]。去势抵抗性前列腺癌是指经过初次持续雄激素剥夺治疗后疾病依然进展的前列腺癌，该病发病迅速，死亡率高，大多伴有转移，预后也较差。目前临床上多以多西他赛化疗法治疗去势抵抗性前列腺癌，有研究表明，多西他赛对患者的预后有稍微的改善，但并不能延长生存时间，而多西他赛化疗法的副作用较大，有的患者无法抵抗加速了死亡。近年来，有研究表明，雷公藤内脂醇可以抑制癌细胞的生长，诱导癌细胞凋亡[4]。在本文的研究中采用从传统中药雷公藤中提取的内酯化合物作用于去势抵抗性前列腺癌PC3细胞，观察其对PC3细胞生长增殖的影响。报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

实验材料是采购于武汉大学典藏中心的人前列腺癌PC3 细胞株。雷公藤内脂醇采购于美国Sigma公司，用无菌双蒸水配制为1.0 mg/ml的储备液，保存在-20°的冰柜内备用。新生牛血清、DMEM培养液、胰蛋白酶购于美国BRL Gibco公司。

1.2 实验方法

细胞培养：PC3 细胞株用含10%新生牛血清、青霉素(100 U/L)及链霉素(100 U/L) 的 DMEM培养基中，放置在室温37 ℃、湿度为5%CO2的孵箱中培养，3～4天传代1次。

细胞增殖抑制率测定：用0.25%的胰蛋白酶消化、传代PC3 细胞，制成单细胞悬液。调整其浓度为4×105cells/ml，接种于96孔板，每孔200 μL。继续培养24 h后，吸出培养液，加入含不同浓度雷公藤内脂醇的培养液100 μL，使其终浓度为5、10、20、40、80、160 nmol/L。设空白组(有培养液，无细胞)和对照组(不加药)，每组5个复孔，放置在室温37 ℃、湿度为5%CO2的孵箱中培养24 h和48 h后采用MTT法检测。用ELX800型全自动酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度值(A)，计算出细胞生长抑制率，实验重复5次，取平均值。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组A均数/对照组A 均数)×100%。

细胞凋亡检测：用含有不同浓度雷公藤内脂醇的培养液培养PC3细胞24 h后收集细胞，分别收集2×106个细胞，用PBS洗涤3次后将细胞充分混匀，再用75%的乙醇固定，4 ℃静置一夜。用PBS洗去乙醇后加入5 μl Annexin.V液和5 μl PI液，混匀，4 ℃避光染色，15 min后立即应用流式细胞仪检测。

细胞培养上清中VEGF含量的测定：用含有10、20、40 nmol/L终浓度的雷公藤内脂醇培养PC3细胞24 h后，收取细胞培养上清液用于检测VEGF的含量。按照试剂盒的说明进行操作，将检测到的不同浓度的VEGF及各组细胞上清液于Rayto 2 100c酶标仪中检测450nm吸光度(A)值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 雷公藤内脂醇作用于PC3细胞后不同时间段形态的变化

在倒置显微镜下可以观察到，用含有雷公藤内脂醇的培养液培养PC3细胞后，细胞的贴壁功能慢慢减退，大部分细胞悬浮在培养瓶中，随着培养时间越来越长，贴壁的部分PC3细胞出现细胞膜皱缩、染色质浓缩、核膜核仁消失、核固缩、出现空泡等现象。培养24 h后此现象更加明显。

2.2 不同浓度雷公藤内脂醇在不同时间点对PC3细胞的生长抑制率

雷公藤内脂醇的浓度为5时，培养24 h和48 h的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)；雷公藤内脂醇浓度为10、20、40 nmol/L时，培养24 h和48 h的抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)；雷公藤内脂醇的浓度为80、160 nmol/L时，培养24 h和48 h的抑制作用差异，明显有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度雷公藤内脂醇在不同时间点对PC3细胞的生长抑制率

2.3 不同浓度雷公藤内脂醇在不同时间点对PC3细胞的凋亡情况

对照组(不加药)在不同时间点对PC3细胞的凋亡作用差异无统计学意义(P>0.05)；雷公藤内脂醇的浓度为10、20、40 nmol/L时，培养PC3细胞12 h、24 h、48 h后对PC3细胞的凋亡作用差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同浓度雷公藤内脂醇在不同时间点对PC3细胞的凋亡情况

2.4 不同浓度雷公藤内脂醇对细胞培养上清中VEGF含量的影响

对照组的VEGF含量为(465.48±30.19)%，雷公藤内脂醇浓度为10、20、40 nmol/L的细胞培养上清中VEGF含量分别为(415.24±22.73)%、(323.57±28.26)%、(251.67±32.61)%，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 不同浓度雷公藤内脂醇对细胞培养上清中VEGF含量的影响

3 讨论

前列腺癌是男性生殖系统中常见的肿瘤，发病率随年龄而增长，前列腺癌的发病率和死亡率仅次于肺癌，位居癌症死亡的第二位。目前治疗前列腺癌的主要方法是内分泌治疗，但大部分患者经过一段时间的治疗后进展为去势抵抗性前列腺癌[5-7]。当患者发展为去势抵抗性前列腺癌时对内分泌治疗药物就会失效，对前列腺肿瘤的发展失去控制，患者的病情愈加恶劣，加速了死亡。因此，寻找新的有效的治疗方法已成为当务之急[8-9]。

分子靶向治疗作为全新的治疗方法在临床治疗癌症中取得了显著的疗效。分子靶向治疗是在细胞分子水平上，以肿瘤细胞的特性改变为作用靶点，在发挥更强的抗肿瘤活性的同时，减少对正常细胞的毒副作用[10-11]。有研究表明，雷公藤内脂醇可以直接作用于癌细胞的多个分子靶点从而产生抗癌作用[12]。在本文的实验中，采用中药雷公藤中提取的内酯化合物作用于去势抵抗性前列腺癌PC3细胞后，在倒置显微镜下可以观察到PC3细胞凋亡的结构变化。根据MTT法检测计算出的细胞生长抑制率结果可知，随着雷公藤内酯醇剂量的增多和培养时间的延长，对PC3细胞增殖的抑制作用越明显。由此可知，雷公藤内酯醇可以促进PC3细胞的凋亡，从而抑制癌细胞的生长增殖。由流式细胞检测结果显示，对照组培养PC3细胞48 h后，细胞凋亡率为(0.51±0.33)%，雷公藤内脂醇的浓度为10、20、40 nmol/L时，培养PC3细胞48 h后细胞的凋亡率分别为(11.25±1.64)%、(27.44±2.97)%、(48.19±2.68)%，明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。表明随着雷公藤内脂醇浓度的增加，PC3细胞的凋亡率也随之升高。当雷公藤内脂醇的浓度为10 nmol/L时，培养12 h、24 h、48 h后的凋亡率分别是(7.53±2.14)%、(9.66±2.34)%、(11.25±1.64)%，组内比较有差异，具有统计学意义(P<0.05)。这就表明相同的雷公藤内脂醇浓度对PC3细胞的凋亡作用随着时间的延长也随之提高。由此提示，雷公藤内脂醇对PC3细胞的凋亡呈现出时间与浓度的依赖性。VEGF是与血管生长相关的因子，它可以刺激肿瘤血管的生长，肿瘤细胞中VEGF的高表达，与其肿瘤的进展、转移密切相关。因此，抑制肿瘤细胞VEGF的含量，就可以达到抑制肿瘤血管生长的目的[13-15]。根据实验结果可知，含量为10、20、40 nmol/L雷公藤内脂醇的细胞培养上清中VEGF含量分别为(415.24±22.73)%、(323.57±28.26)%、(251.67±32.61)%，与对照组(465.48±30.19)%相比，差异有统计学意义(P<0.05)。表明随着雷公藤内脂醇浓度的增加，细胞培养上清中VEGF的含量就越少。由此可知，雷公藤内脂醇可以下调肿瘤细胞VEGF的含量，抑制肿瘤血管的新生，降低肿瘤细胞的扩散。

综上所述，雷公藤内脂醇作用于PC3细胞后可以下调肿瘤细胞VEGF的含量，抑制肿瘤血管的新生，从而诱导细胞凋亡，抑制细胞生长增殖。