刘素娟，杨蒙蒙，黄浩，赵世杰，朱庆伟，郭元平，苏爽月

(牡丹江师范学院 化学化工学院，黑龙江 牡丹江 157011)

1 概述

果酒和果醋有缓解疲劳，促进钙吸收，预防高血压，预防心脏病和降低血清总胆固醇水平等作用。这些作用主要来源于有机酸、酚类物质和醇类物质的互相作用。其中酚类物质是植物次生代谢物，不仅具有各种生理活性功能，还影响着水果的风味和质量品质[1-3]。

目前酚类物质的分析方法有分光光度法[4]、气相色谱法[5]和液相色谱法等[6]。4-氨基安替比林分光光度法溶剂使用量大，富集效果差，蒸馏时间长，易造成二次污染[7]；气相色谱法测定酚类物质，需要进行多次液-液萃取和衍生化反应，操作过程较为繁琐[8]；而高效液相色谱(HPLC)法适用于检测分子量较大、沸点较高、热稳定性差的有机物，弥补了气相色谱法的不足[9]，可对酚类物质进行直接测定，无需进行衍生化反应，且分离度好，灵敏度高。因此，本文通过高效液相色谱仪对果酒和果醋中10种酚类物质进行分析(对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚、咖啡因、香草醛、苯酚、阿魏酸、对硝基苯酚、对氯苯酚、1-萘酚)，本方法操作简便、快捷，实验结果准确、可靠，与同类分析方法相比较在缩短分离时间上具有明显优势[10-13]。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

2695-2998高效液相色谱仪 美国Waters公司；SB-5200DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；SQP电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；Milli-Q超纯水仪 美国密理博公司；酚标准品 Sigma公司；其他试剂均为HPLC级别；实验用水均为超纯水。

2.2 色谱条件

2695-2998高效液相色谱仪(美国Waters公司)。配备2998型二极管阵列检测器，Empower3色谱工作站。色谱柱为UltimateXB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相A为甲醇-乙酸-水(90∶2∶8)，流动相B为甲醇-乙酸-水(10∶2∶88)，具体流动相梯度见表1，检测波长为280 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为60 ℃，进样量为10 μL。在上述色谱条件下，标样色谱图见图1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of flow phase

2.3 标准溶液的配制

用万分之一分析天平准确称取适量10种酚类化合物，分别置于50 mL烧杯中，咖啡因和香草醛用乙醇溶解，其余均用超纯水溶解，并用超声波清洗器辅助溶解，然后转移至50 mL容量瓶中，均用超纯水定容至刻度线，得到标准溶液。使用前稀释到所需浓度，进样前均经0.45 μm滤膜过滤。

2.4 样品处理

准确移取10.00 mL超市购买的果酒和果醋于不同的50 mL容量瓶中，加入超纯水定容，超声波清洗器脱气5 min，经0.45 μm滤膜过滤待测。

3 结果与讨论

3.1 检测波长的确定

用紫外-可见分光光度计对10种酚类物质标准溶液从200～400 nm进行扫描，发现最大紫外吸收波长均在280 nm外，在此波长下测定灵敏度高，峰形好，因此本实验采用检测波长为280 nm。

3.2 流动相及梯度洗脱条件的确定

流动相在高效液相色谱法中至关重要，考察了甲醇-乙酸-水、乙腈-水作为流动相的分离效果。结果表明，10种酚类物质在甲醇-乙酸-水体系中分离效果较好，通过反复摸索调整梯度洗脱程序，峰形和分离度达到要求。流动相A为甲醇-乙酸-水(90∶2∶8)，流动相B为甲醇-乙酸-水(10∶2∶88)，流速为1.0 mL/min，洗脱程序见表1。结果表明，10种酚类物质在25 min之内均得到了良好的分离，此条件下标准品的色谱图见图1。

图1 10种酚类标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of 10 phenolics standard samples

注：1为对苯二酚，2为间苯二酚，3为邻苯二酚，4为咖啡因，5为香草醛，6为苯酚，7为阿魏酸，8为对硝基苯酚，9为对氯苯酚，10为1-萘酚。

3.3 流速和柱温的确定

对流动相的流速和柱温进行了优化选择。选择0.8，1.0，1.2 mL/min这3种不同的流速来考察10种酚类物质的分离效果。实验表明，流速为0.8 mL/min时，1-萘酚的保留时间为25.80 min，保留时间较长；流速为1.2 mL/min时，香草醛与苯酚没有达到基线分离；1.0 mL/min时，1-萘酚的保留时间为24.275 min，香草醛与苯酚的分离度较大。综合考虑保留时间和分离效果，最终选择1.0 mL/min。

柱温影响保留时间、柱效、选择性等。当温度升高时，分析时间缩短，仪器压强降低；温度较低时，仪器压强升高，保留时间延长。控制流速均为1.0 mL/min，在35，40，45，50，55，60 ℃下进行实验，探究色谱柱温度对10种酚类物质分离度的影响。结果表明，随着温度的升高，10种酚类物质的保留时间逐渐缩短。柱温从35 ℃改变至60 ℃时，10种酚类物质的保留时间从26.50 min缩短至24.275 min。色谱柱的最大承受温度为65 ℃，综合实验结果，选择60 ℃为最佳实验温度。

3.4 标准曲线及检出限

将10种酚类物质的标准混合溶液逐步稀释，配制成浓度分别为400，200，100，50，10 mg/L的混合标准溶液，在最佳色谱条件下进行检测，根据实验结果，绘制10种酚类物质的标准曲线，得出线性方程及相关系数，实验结果见表2。

表2 线性方程及相关系数Table 2 Linear equations and correlation coefficients

由表2可知，10种酚类物质的线性关系良好，并且检出限较低，说明方法灵敏度较高。

3.5 回收率及精密度的测定

在实验确定的最佳色谱条件下，选取1#果酒样品，分别加入10，50，100 mg/L标准混合溶液，平行进行6次实验，实验结果见表3。回收率为81.6%～102.8%，相对平均偏差不大于4.4%，说明方法精密度高，准确度好。

表3 回收率及精密度Table 3 Recoveries and precision

续 表

3.6 实际样品的测定

本实验购买了超市销售的果酒和果醋。在最佳色谱条件下对多种果酒和果醋进行了检测，检测结果见表4，典型代表色谱图见图2。

表4 样品中酚类物质的含量Table 4 The content of phenolics in samples mg/L

注：“-”表示未检出。

图2 1#果酒色谱图Fig.2 Chromatogram of 1# fruit wine

注：1为对苯二酚，2为间苯二酚，3为邻苯二酚，4为苯酚。

结果表明，果酒主要含有的酚类物质为对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚、苯酚。其中仅3#果酒含有咖啡因；2#果酒不含间苯二酚、邻苯二酚和咖啡因；5#葡萄酒只含咖啡因，4#果醋只含有间苯二酚。

4 结论

采用高效液相色谱-二极管阵列联用技术对10种酚类物质进行分离与测定，在实验确定的最佳条件下，10种酚类物质在25min内达到完全基线分离。本方法检测速度快，精密度高，可靠性好，操作步骤简单，样品处理方法简单，对于果醋、果酒的检测很有实用价值。