张晓旭，周锡钦，严江，刘红芹*，徐宝财

(1.北京工商大学 食品学院 北京市食品风味化学重点实验室食品添加剂与配料北京工程研究中心，北京 100048；2.北京味食源食品科技有限责任公司，北京 101200)

辣椒提取物辣椒碱、辣椒二氢碱和辣椒红色素等不仅可以作为食品添加剂，还可以应用到医药和军事等领域[1-3]。我国目前对辣椒碱和辣椒二氢碱等有效成分的提取还处于初级阶段，由于生产规模小，工艺设备落后，导致辣椒在我国的深加工及市场应用方面一直比较低迷。目前，酶法提取已广泛应用于植物活性成分的提取，如酶法提取脂肪酸和黄酮等[4-6]。

然而，由于酶促反应涉及的步骤增加及后处理导致的成本增加，使得酶促反应的工业应用受到一定限制。研究表明，酶促反应中添加表面活性剂，不仅可以提高酶的水解速率，还可以降低酶的负载[7-9]。目前，表面活性剂辅助酶解技术很少涉及食品工业。本文利用酶和表面活性剂辅助提取辣椒中的辣椒碱、辣椒二氢碱、辣椒红色素，通过单因素试验和正交试验优化其提取工艺，考察酶和表面活性剂添加量、酶解温度和酶解时间等对其提取率的影响规律，为辣椒的精加工和综合利用提供一定的科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辣椒 北京味食源食品有限公司；辣椒碱、辣椒二氢碱、辣椒红色素标准物质(≥98%) Dr.Ehrenstorfer GmbH；纤维素酶(酶活力50000 U/g) 河南亚通食品原料有限公司；乙醇(分析纯)、甲醇(色谱纯) 北京化工厂；食品级硬脂酰乳酸钙(CSL)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、吐温-80和司潘-60 济南兰欣生物技术有限公司。

1200型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；UV Vis Spectrophotometer(UV-3600) 北京瑞丽分析仪器有限公司；高速万能破碎机(DGF-100) 黄陂解放仪器厂；电子天平(FA1004N) 上海精密科学仪器有限公司；电加热水浴锅(DY-H) 上海圣奇仪器有限公司；高速离心机(TG16) 长沙英泰仪器有限公司；KQ-250D 超声波清洗器 昆山市超声波仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 辣椒碱和辣椒二氢碱的提取

辣椒去籽，粉碎，称取5.0 g，加入40 mL蒸馏水和0.3%(W/W)的纤维素酶，50 ℃反应2 h后进行离心分离，取上清液，残渣用甲醇与四氢呋喃的混合溶液(1∶1，V/V)进行超声提取，温度60 ℃，功率70 W，提取时间1 h，过滤，得到包含辣椒碱和辣椒二氢碱的滤液。

1.2.2 辣椒红色素的提取

辣椒去籽，粉碎过筛，称取 5.0 g，加入40 mL蒸馏水和0.2% (W/W)的纤维素酶，50 ℃反应2 h后进行离心分离，取上清液，残渣用40 mL丙酮浸提剂，超声提取30 min，过滤，得到包含辣椒红色素的滤液。

1.2.3 绘制辣椒碱标准曲线

图1 辣椒碱(A)、辣椒二氢碱(B)和辣椒红色素(C)的标准曲线

用甲醇和四氢呋喃的混合溶液1∶1(V/V)配制浓度分别为0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 mg/mL的辣椒碱标品溶液，进行高效液相色谱(HPLC)测定，以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线(见图1中A)：辣椒碱在0.01～0.5 mg/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=4270.6x-10.564，r2=0.9999。

1.2.4 绘制辣椒二氢碱标准曲线

用甲醇和四氢呋喃的混合溶液1∶1(V/V)配制浓度分别为0.004，0.021，0.034，0.052，0.170 mg/mL的辣椒二氢碱标品溶液，进行HPLC测定，以标品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线(见图1中B)：辣椒二氢碱在0.0042～0.170 mg/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=3363.8x+4.2657，r2=0.9996。

1.2.5 绘制辣椒红色素标准曲线

用丙酮配制浓度分别为0.38，0.33，0.29，0.23，0.046，0.033 mg/mL的辣椒红色素标品溶液，以丙酮作参比，于波长460 nm 处测吸光度，以标品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线(见图1中C)：辣椒红色素在0.033～0.38 mg/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=5.5226x-0.0112，r2=0.9999。

1.3 测定方法

1.3.1 辣椒碱和辣椒二氢碱的测定

以HPLC法测定其含量，色谱条件：色谱柱为反相C18柱(15 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相为甲醇∶水为80∶20(V/V)，流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长为760 nm，进样体积为10 μL。辣椒碱、辣椒二氢碱的含量采用面积外标法计算。

1.3.2 辣椒红色素的测定

利用紫外可见分光光度计在460 nm处测量辣椒素含量。辣椒红色素的含量采用面积外标法计算。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

通过单因素试验，分析纤维素酶添加量、料液比、酶解时间、酶解温度、辣椒粒度、表面活性剂类型和表面活性剂添加量这7个因素对提取辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响。

2.1.1 酶添加量对辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响

固定酶解时间为2 h，酶解温度为50 ℃，料液比为1∶8 (g/mL)，试验考察了纤维素酶添加量对辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响，试验结果见图2。

图2 添加酶与空白组对比(A)、酶添加量(B)、料液比(C)和酶解时间(D)对辣椒碱、辣椒二氢碱和辣椒红色素含量的影响

由图2中A可知，添加酶的试验组中，辣椒碱、辣椒二氢碱和辣椒红色素的含量均较空白组高。且由图2中B可知，3种物质的含量随酶添加量的增大而增大，在酶添加量为0.3%(W/W)时，辣椒碱、辣椒二氢碱的含量达到最大值。在酶添加量为0.2%(W/W)时，辣椒红色素的含量达到最大。分析原因可能是，当酶添加量较低时，底物过量，酶解不完全，致使辣椒中的有效成分溶出率不高，随着酶添加量的增加，酶解作用增加，辣椒中关键物质的溶出率也随着增加，而当酶添加过量时，由于酶与底物的结合饱和，3种物质的含量不会继续增长。

2.1.2 料液比对辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响

分别固定纤维素酶添加量为0.3%(辣椒碱、辣椒二氢碱的提取试验)和0.2%(辣椒红色素的提取试验)，其他条件保持不变，试验考察了料液比对辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响，试验结果见图2中C。

由图2中C可知，随着料液比的增加，辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素的含量先增加后降低。当料液比较低时，反应体系的粘度降低，有利于底物的水解，使辣椒细胞中有效物质的扩散增加，反应更加充分。随着料液比的进一步增加，酶的浓度大大降低，不利于酶与底物的紧密接触，从而降低了底物的水解率，关键物质的提取率也随之降低。因此，提取辣椒碱和辣椒二氢碱的最佳料液比为1∶8(g/mL)，提取辣椒红色素的最佳料液比为1∶7(g/mL)。

2.1.3 酶解时间对辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响

在最适酶添加量和料液比的试验条件下，其他条件不变，试验考察了酶解时间对辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响，试验结果见图2中D。

由图2中D可知，随着酶解时间的增加，辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素的含量先增加后降低。原因可能是，随着时间的增加，酶解反应充分，有利于辣椒细胞中关键物质的溶出，而当酶解时间过长时，辣椒中的辣椒碱和辣椒二氢碱等有效物质会有一部分分解，导致其含量降低。综合比较，提取辣椒碱和辣椒二氢碱的最适酶解时间为3 h，提取辣椒红色素的最适酶解时间为2 h。

2.1.4 酶解温度对辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响

图3 酶解温度(A)和辣椒粒度(B)对辣椒碱、辣椒二氢碱和辣椒红色素含量的影响

在酶解时间、酶添加量和料液比均为上述试验中的最佳条件下，试验考察了酶解温度对辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响，试验结果见图3中A。

由图3中A可知，随着酶解时间的增加，辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素的含量先增加后降低。原因可能是，温度与酶解时间有关，酶解时间短，失活不明显，最佳温度较高；反应时间越长，最佳温度越低。由于这种关系，酶的最适温度只有在一定条件下才有意义，同时由于温度过高，会导致部分酶失活。因此，确定提取辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素的最适酶解温度均为50 ℃。

2.1.5 辣椒粒度对辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响

固定酶解温度、酶添加量、酶解时间和料液比均为上述试验的最佳条件下，试验考察了辣椒粒度对辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响，试验结果见图3中B。

由3中B可知，3种物质的含量均随着粒度的增加呈现先增加后减小的趋势，其原因可能是材料破碎后，颗粒尺寸变小，表面能增加，细胞内物质浸出速度增加。但是，随着物料粒度的进一步减小，样品粉末的表面积过大，吸附效果增强，不利于细胞中物质的浸出。综合分析，确定提取辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素的最佳粒度为100目。

2.1.6 表面活性剂对辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素含量的影响

图4 表面活性剂种类(A)和SSL添加量(B)对辣椒碱、辣椒二氢碱和辣椒红色素含量的影响

试验表明，在酶反应过程中加入表面活性剂可以提高酶解效率。表面活性剂的存在可以通过减少“更多的剩余表面”来减少溶液的表面张力，且可以防止纤维素酶与空气表面接触并稳定纤维素酶的活性[10]。此外，在胶束体系中，疏水性底物将被隔离在表面活性剂分子的聚集体内，并且可用于酶催化水解反应的有效底物浓度将不等于总底物浓度，可与酶相互作用的底物浓度也将取决于表面活性剂的性质、底物与表面活性剂的比例以及其他反应条件，如pH和温度。同时，由于胶束表面的吸附或解吸，活性表面活性剂的浓度也会因不同的表面活性剂而变化[11]。因此，本文考察了酶解反应中添加硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、吐温-80和司潘-60等表面活性剂对3种物质提取率的影响，每种表面活性剂的加入量约为0.5%(W/W)，研究结果见图4中A。由图4中A可知，添加SSL的时候，3种物质的提取含量均达到最大。因此，本试验对SSL 的添加量做了进一步的优化试验，试验结果见图4中B。由图4中B可知，提取辣椒碱、辣椒二氢碱的SSL的最佳添加量为0.4%(W/W)，提取辣椒红色素的SSL的最佳添加量为0.3%(W/W)。

2.2 正交试验

为了更科学合理地确定提取辣椒碱、辣椒二氢碱及辣椒红色素的最优工艺，在单因素试验的基础上，继续采用L18(36)正交表进行正交试验，因素水平表和试验结果分析表分别见表1和表2。

表1 提取辣椒碱和辣椒二氢碱的正交试验的因素水平表

表2 提取辣椒碱和辣椒二氢碱的正交试验的结果分析表

由表2可知，各因素对提取辣椒碱含量影响的主次顺序为：酶解时间>酶解温度>酶添加量>料液比>SSL的添加量>粒度；各因素对提取辣椒二氢碱含量影响的主次顺序为：酶解时间>酶添加量>酶解温度>粒度>料液比>SSL的添加量，而最优水平组合为A3B1C2D1E3F2，即纤维素酶添加量0.4%(W/W)、酶解时间4 h、酶解温度45 ℃、料液比1∶8 (g/mL)、SSL的添加量1%(W/W)、辣椒粒度100目，此时，辣椒碱的含量可达7.82 mg/g，辣椒二氢碱的含量为4.94 mg/g。

表3 提取辣椒红色素的正交试验的因素水平表

表4 提取辣椒红色素的正交试验的结果分析表

由表3和表4可知，各因素对提取辣椒红色素含量影响的主次顺序为：粒度>酶解时间>SSL的添加量>料液比>酶解温度>酶添加量，而其最优水平组合为A2B3C3D1E1F2，即酶添加量0.8 %(W/W)、酶解时间2 h、酶解温度55 ℃、料液比1∶5(g/mL)、SSL的添加量0.6%(W/W)，辣椒粒度为粉碎后过100目筛，此时，辣椒红色素的含量为31.25 mg/g。

3 结论

通过单因素试验和正交试验初步确定了表面活性剂辅助酶解法提取辣椒碱、辣椒二氢碱的最优条件为：纤维素酶添加量为0.4%(W/W)，酶解时间为4 h，酶解温度为45 ℃，料液比为1∶8 (g/mL)，SSL的添加量为1%(W/W)，辣椒粒度为100目；提取辣椒红色素的最优条件为：纤维素酶的添加量为0.8 %(W/W)，酶解时间为2 h，酶解温度为55 ℃，料液比为1∶5 (g/mL)，SSL的添加量为0.6%(W/W)，辣椒粒度为粉碎后过100目。在此优化条件下，辣椒碱的含量可达7.82 mg/g，辣椒二氢碱的含量为4.94 mg/g，辣椒红色素的含量为31.25 mg/g，相比不添加酶的空白处理，分别增加了3.53，2.82，20.01 mg/g，3种物质的含量都达到了较高水平，有用于实际生产的应用前景。同时研究还表明，表面活性剂辅助酶解提取法可以有效降低酶解工艺中的成本，在天然产物有效成分的提取中具有广阔的应用前景。