吴雪娇，王旭旭，张伟，苑宁

(河北农业大学 理工学院，河北 沧州 061100)

纳豆是日本已经发展成熟的传统食品[1]，是以大豆等豆类为原料，经过纳豆菌发酵而制成的食品，除了含有大豆本身的营养成分外，还含有很多通过发酵作用产生的功能性物质，使得纳豆具有多种保健功能，尤其是1987年须见洋行博士首次分离的纳豆激酶，具有很好的溶解纤维蛋白的作用，与溶栓药物相比有明显优势，除此之外，酚类、黄酮类以及多种抗菌素起到了抗癌、抗菌、抗氧化的作用，丰富的维生素在某种程度上能促进钙的吸收，预防骨质疏松，碱性蛋白酶等酶类的产生能够调节肠道功能，保护消化系统。因此，经常食用可以提高人体的免疫力，改善体质，预防疾病，纳豆作为一种功能性食品，在多个国家广受欢迎[2-4]。

传统的发酵纳豆，带有令中国消费者很难接受的 苦味和氨味，因此在中国的市场上销售很少[5-8]，一般在一些日资超市才能见到，但是销售情况也并不理想。本实验通过菌种选择、改善C/N、辅料添加等方法来考察不同处理对纳豆风味的影响，以期去除纳豆特有的氨味，生产出符合中国人饮食习惯的纳豆产品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆、白糖、糯米、甜酒曲、酵母粉、花椒、大料、十三香粉、酸奶、橙子、柠檬：市售；酵母粉：安琪酵母股份有限公司；纳豆菌1：广东顺德尚川生物科技有限公司；纳豆菌2：北京川秀国际贸易有限公司。

煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)：北京陆桥技术股份有限公司；氢氧化钠(粒)、无水碳酸钠、硫酸铜：天津市东丽区天大化学试剂厂；酒石酸钾钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；福林酚：北京索莱宝科技有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

生化培养箱、立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司；电磁炉 浙江绍兴苏泊尔生活电器有限公司；低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；722可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；烘箱、电热恒温培养箱 北京中兴伟业仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 纳豆的制作工艺

浸泡→蒸煮→接菌→发酵→后熟[9]。

1.3.1.1 浸泡

选择颗粒饱满的黄豆，除去碎粒、虫蛀等次品。取一定量黄豆，以黄豆∶水为 1∶7置于生化培养箱中，调温至10 ℃，静止浸泡15 h左右。

1.3.1.2 蒸煮

取出浸泡后的黄豆，豆子稍微有点硬。将豆子放入电饭锅中，100 ℃蒸煮50 min左右[10]。

1.3.1.3 接菌

参照所买纳豆菌的使用说明，待蒸煮好的黄豆降温至40 ℃左右，用40 ℃左右的水溶解纳豆菌0.8%，均匀地撒在豆子上。

1.3.1.4 发酵

将接好菌的黄豆分装至纸杯中，每杯的豆子高度不超过4 cm，用保鲜膜封口后扎孔，放入生化培养箱中培养，于40 ℃发酵20 h左右[11]。

1.3.1.5 后熟

取出发酵后的豆子，将扎孔的保鲜膜去除，用不扎孔的保鲜膜封口，置于冰箱中冷藏[12]。

1.3.2 菌种的选择

本实验采取3个实验组探讨不同菌种对纳豆风味的影响。实验菌种分别为纳豆菌、纳豆菌+酵母粉、纳豆菌+甜酒曲。

1.3.3 改变C/N改良纳豆风味

为改变C/N，本实验主要采用以下方法：

将清水浸泡并蒸完的豆子接入0.8%纳豆菌，分别加2%，10%白糖，发酵培养并后熟；

清水浸泡适量黄豆后取出，撒2%，10%白糖于黄豆上蒸50 min，接种0.8%纳豆菌然后发酵并后熟。

1.3.4 辅料添加掩盖纳豆不良风味

花椒、大料处理：花椒、大料按1∶2放入水中煮开，晾凉后用该水浸泡黄豆适量；然后置于电饭锅中蒸50 min，蒸的过程中锅底部继续放花椒大料调料水；接0.8%纳豆菌后发酵并后熟。另一组实验用相同的辅料将大豆煮软后发酵。

十三香处理：清水中加入适量十三香粉煮开，晾凉后用该水浸泡黄豆适量，然后用十三香水煮豆子，接菌后发酵并后熟。

咖喱粉处理：清水浸泡适量黄豆后继续用清水煮豆子，中间加入4%的咖喱粉调味，接入0.8%纳豆菌后发酵并后熟。

果皮处理：清水浸泡黄豆适量，用柚子皮、橙子皮包住黄豆后，置于电饭锅里蒸40 min左右，然后接入0.8%纳豆菌后发酵并后熟。

1.3.5 改变C/N同时添加辅料改善纳豆风味

取用糖蒸方法完成的纳豆分别加入等量的酸奶、半个橙子、两片柠檬。

取用花椒大料水煮完的纳豆加入8%白糖、等量的酸奶、半个橙子、两片柠檬。

1.3.6 纳豆的感官评价方法

由16位受过专业训练的人员组成感官评价小组，首先对市售的纳豆进行评价，然后对本实验完成的各种纳豆进行感官测评，评价标准见表1。由于本实验的主要目的是改善纳豆的风味，因此评价的标准主要以气味和口感为主，依次对表1中的指标进行评定[13]。鉴评由每人独立完成，换样品前用温水漱口，5 min后鉴评下个样品。

表1 纳豆感官评价标准[14]Table 1 The sensory evaluation criteria of natto

1.3.7 纳豆的理化指标检测

水分含量的测定：参考GB 5009.3—2013《食品安全国家标准 食品中水分的测定》；氨基酸态氮的测定：参考GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》[15]。

粘多糖的测定：用黏液率表示。取5.00 g纳豆分成2份，1份用温水轻轻洗掉纳豆表面的黏液，然后将其转移到烘箱中烘至重量不变，记为m1；另1份直接在烘箱中烘至重量不变，记为m2，温度调为105 ℃，(m2-m1)/m1所得数据即为黏多糖产率[16]。

1.3.8 微生物指标的检测

大肠杆菌的测定：参考GB 4789.3—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》。

1.3.9 纳豆激酶活性的测定[17,18]

采用Folin-酚法测定纳豆激酶活性，首先用标准品绘制出标准曲线，然后进行样品测定。此方法灵敏度高且操作简便。

1.3.9.1 标准曲线的制作

取14支试管分成2组，制定出不同浓度的标准蛋白质，然后于500 nm处比色。测定吸光值，取2组测定的平均值，以酪氨酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.9.2 样品的测定

称取1 g纳豆，放入离心管中，加入10 mL蒸馏水，放入离心机4000 r/min离心10 min取上清液，即粗酶液，将上清液倒入10 mL刻度试管中，即为样品溶液。

取 1 mL 样品溶液加入5 mL 试剂甲混匀，于20～25 ℃放置10 min，再加0.5 mL试剂乙(Folin-酚)，立即摇匀，记录反应总体积为6.5 mL。在 20～25 ℃保温30 min，然后于500 nm 处比色，以 0 mL标准蛋白代替作空白对照。

样品酶活力大小与吸光值之间的关系：X=A×K×6.5/10×a。

式中： X为酶活大小(U/g)； A为样品测定的吸光度； K为吸光常数(吸光值为1时酪氨酸的量)；6.5为反应的总体积(mL)；10为反应时间10 min；a为稀释倍数。

1.3.10 数据处理

每组实验做3次，取平均值，用Excel 2003作图，计算平均值及标准偏差，做相关性分析。

2 结果与分析

2.1 发酵菌种对纳豆的影响

通过纳豆菌、酵母菌以及甜酒曲对大豆进行发酵处理，所得最终产品感官评分见图1。

图1 不同菌种添加对纳豆的影响Fig.1 The effects of different strains on natto

由图1可知，加入酵母菌及甜酒曲的效果均没有原有纳豆的评分高。实验证实，酵母菌及糖化菌与纳豆菌形成的混合菌种对纳豆的风味没有起到改善作用。

2.2 改变C/N对纳豆的影响

通过在不同环节加入适量白糖的方法改变C/N，对上述实验方法完成的纳豆进行感官评价的结果见表2。

表2 C/N对纳豆的影响Table 2 The effects of different C/N on natto

由表2可知，在不加入混合菌种的情况下，提高C/N可以在一定程度上改善纳豆的风味，尤其是在蒸豆子的环节中用10%糖蒸效果更佳。

2.3 辅料添加对纳豆的影响

对上述实验方法完成的纳豆进行感官评价的结果见表3。

表3 辅料添加对纳豆的影响Table 3 The effects of different auxiliary materials on natto

实验证实，在浸泡豆子时用花椒大料水，并且在蒸豆子时底部继续放入花椒大料水，对纳豆的风味改善有明显作用。

2.4 混合处理对纳豆的影响

通过改变C/N同时添加辅料等方法对纳豆进行混合处理，对上述实验方法完成的纳豆进行感官评价的结果见表4。

表4 改变C/N同时加辅料对纳豆的影响Table 4 The effects of different C/N and auxiliary materials on natto flavor

实验证实，在提高C/N的同时添加辅料均对纳豆的风味改善有不同程度的提高，其中10%糖蒸后加酸奶(以下简称酸奶纳豆)的纳豆产品效果最好。

2.5 酸奶纳豆产品的理化指标

2.5.1 水分含量

水分含量=61.02%，满足SB/T 10528-2009纳豆行业标准中规定的纳豆水分含量≤65%的要求。

2.5.2 黏液率

黏液率=5.72%。

2.5.3 氨基酸态氮

氨基酸态氮=19.18 g/dL，满足SB/T 10528-2009纳豆行业标准中规定的纳豆氨基酸态氮≥0.3 g/100 g的要求。

2.5.4 大肠菌群

10-2稀释液，在VRBA平板上有40个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有2个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：40×2/10×102mL=8×102cfu/mL。

2.6 产品中纳豆激酶的活性

根据所测数据绘制标准曲线，见图2。

图2 标准曲线的绘制Fig.2 The standard curve

所得标准曲线的线性方程为：y=0.0107x+0.0055，R2=0.9996。

样品的测定：测得酸奶纳豆制成样品的吸光度为0.903。

样品酶活力大小：X=A×K×6.5/10×a=0.903×92.94×6.5/10×1=54.55 U/g。

3 结论

本实验中酵母菌和甜酒曲的添加对纳豆风味的影响不显著，改变纳豆C/N可以从根本上改变纳豆的风味，添加适当的辅料对提高纳豆风味有一定作用。本实验研究表明，加10%糖，蒸50 min，发酵20 h，与等量酸奶混合，后熟，可以很大程度上改变纳豆风味，产品的香气和滋味协调，纳豆所带氨味最少，易于被国人接受，含水量61.02%，黏液率5.72%，氨基酸态氮19.18 g/dL，大肠杆菌8×102cfu/mL，符合国家标准，纳豆激酶酶活为54.55 U/g。