赵娜，舒丹阳，崔春*

(1.无限极(中国)有限公司，广州 510640；2.华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510640)

酱油是我国传统大宗发酵调味品，其产量占世界总产量的60%以上。酱油俗称豉油，是以非转基因大豆(粕)、小麦(粉)为原料，通过固态制曲、液态发酵、过 滤、杀菌和调配等工艺酿制而成。酱油的成分比较复杂，除食盐的成分外，还有丰富的氨基酸、寡肽、多肽、糖类、有机酸等呈味成分。小麦酱油是以小麦粉、小麦面筋蛋白为主要原料，通过制曲、液态发酵等工艺得到的液态调味品，如雀巢的美极鲜味汁等。

pH值对蛋白质、淀粉等大分子物质酶法降解、美拉德反应以及微生物生长和发酵均有显著影响[1，2]。酱油发酵过程中大豆蛋白和小麦蛋白在蛋白酶的作用下降解为游离氨基酸、寡肽和小分子蛋白；淀粉降解为葡萄糖和寡糖，并在乳酸菌的作用下发酵产乳酸、乙酸等有机酸[3]，这些都导致酱油的pH值从发酵初期的6.5～6.0下降到5.0～5.5。米曲霉发酵产生的蛋白酶以碱性蛋白酶和中性蛋白酶为主，酸性蛋白酶活力降低[4]。酱油发酵过程中pH值下降，偏离了米曲霉产中性蛋白酶和碱性蛋白酶的最适条件，导致酱油液态发酵效率下降。此外，pH值降低还导致美拉德反应速度下降，酱油色率偏低[5]。因此，本文尝试在小麦酱油发酵过程中通过定期添加碱保持pH值稳定在6.5左右，研究不同pH值对酱油发酵的影响，以期为优化酱油工业化生产提供理论指导。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

米曲霉曲精(Aspergillusoryzae)沪酿 3.042：济宁玉园生物科技有限公司；谷朊粉：郑州全盛商贸有限公司；面粉、食盐：均为市售。三氯乙酸、浓硫酸、甲醛：国药集团化学试剂有限公司；3，5-二硝基水杨酸：上海润捷化学试剂有限公司；钴胺素、细胞色素C、牛血清白蛋白：分析纯，上海展云化工有限公司；5-磺基水杨酸：分析纯，上海邦景实业有限公司。

1.2 主要仪器设备

仪器名称与生产商见表1。

表1 仪器名称与生产商Table 1 Names of instrument and manufacturers

1.3 实验与分析方法

1.3.1 小麦酱油制曲工艺

取谷朊粉780 g，面粉420 g，加水1200 g混合拌匀，置于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃蒸5 min，室温下冷却至40 ℃左右，装入筐中。取60 g面粉与0.36 g米曲霉曲精混匀，将其均匀拌入已冷却的蒸料中，曲精添加量为0.03%，将拌匀的曲放入培养箱。发酵桶彻底清洗消毒，将制好的曲装至发酵桶中，加入2.25倍曲量的盐水(17%)，放至阳台阴凉处自然发酵，其中自然发酵的一桶不添加氢氧化钠调节其pH值，发酵70天后pH值为5.4(标记为pH 5.4)；另外一桶在发酵20，30，40，50，60天时用6 mol/L NaOH 调节至pH 6.5(标记为pH 6.5)。2桶酱油的发酵周期均为70天，分别在酱醪发酵时间为40，45，50，55，60，65，70天取样。酱油取样后在8000 r/min冷冻离心20 min得上清液。

1.3.2 总氮和氨态氮的测定

总氮含量测定方法为凯氏定氮法，氨基酸态氮含量测定采用甲醛滴定法，使用自动电位滴定仪进行测定，参考GB 18186—2000。

1.3.3 酱油色泽、总糖和还原糖含量的测定

红色指数和黄色指数的测定参考李丹等[6]的方法。总糖的测定采用苯酚-硫酸法，还原糖的测定采用DNS法，参考GB/T 15672—2009。

1.3.4 游离氨基酸和游离氨基酸组成的测定

氨基酸检测条件：4 mL样品与1 mL 15%的磺基水杨酸溶液混合沉淀样品中大分子的蛋白和多肽，4 ℃下反应1 h，4 ℃ 10000×g离心15 min。过滤，样品经过微滤膜(0.22 μmol)处理。用液相离子交换柱(分离柱TS263，membraPure)分离氨基酸，茚三酮显色，流速为60 μL/min，除脯氨酸检测波长为440 nm外，其余均在570 nm处检测。各氨基酸浓度采用外标定量。总氨基酸组成的测定：酶解产物经过5 mol/L盐酸水解，水解温度为110 ℃，水解时间为22 h，水解结束后进行总氨基酸组成的测定。

1.3.5 谷氨酰胺酶活力的测定

谷氨酰胺酶活力根据崔春等[7]的方法测定。

1.3.6 酱油分子量的测定

采用凝胶色谱法测定肽的分子量分布。检测条件：Waters 600高效液相色谱，TSK gel G2000SWXL分析柱；洗脱液为0.04 mol/L磷酸缓冲液，流速为1 mL/min，检测波长为214 nm。标准肽样品：Conalbumin(75,000 Da)，Oralbumin (43,000 Da)， Cytochrome-c(12,384 Da)， Aprotinin(6,512 Da)，Vitamin B12(1,855 Da)，Glutathione (307 Da)。

1.3.7 感官评价

参照GB/T 16291.1—2012的方法[8]，并根据实际情况做简略处理。评价小组为实验室中4名男生、5名女生。首先配制5种标准滋味溶液，分别为0.35%谷氨酸钠溶液、1%蔗糖溶液、0.7%氯化钠溶液、0.08%柠檬酸溶液、0.5% L-异亮氨酸溶液。评价员首先对5种标准溶液进行品尝鉴定，然后分别对2种酱油进行滋味鉴定，0～10分制。定量分析结果以雷达图显示。

2 结果与讨论

2.1 不同pH发酵条件下酱油成熟期总氮、氨基酸态氮的变化

图1 pH值对小麦酱油成熟期总氮和氨基酸态氮含量的影响Fig.1 The effect of pH values on the total nitrogen and ammonia nitrogen content in the maturation period of wheat soy sauce

由图1中a可知，2种酱油在40～70天内总氮呈总体上升趋势，且pH值为5.4的酱油中含有更高的总氮值。pH 5.4条件下发酵的酱油总氮值由40天时的1.44 g/dL逐渐升高，至发酵55天时达到约1.53 g/dL，此后总氮含量逐渐趋于稳定。而pH 6.5条件下发酵的酱油总氮则由40天时的约1.4 g/dL逐渐升高至约1.5 g/dL，略低于pH 5.4条件下发酵的酱油。

由图1中(b)可知，2种酱油的氨基酸态氮在成熟期的变化趋势与总氮变化趋势基本一致。pH 5.4条件下的酱油氨基酸态氮由40天时的约0.99 g/dL逐渐升高至约1.06 g/dL。pH 6.5条件下的酱油发酵55～60天有较为明显的升高，而后逐渐升高至与pH 5.4条件下酱油相同的氨基酸态氮值。

2.2 不同pH发酵条件下酱油的谷氨酰胺酶活力变化规律

图2 不同pH发酵条件下酱油成熟期谷氨酰胺酶活力的变化Fig.2 Changes of glutamine enzyme activity during the maturation period of soy sauce under different pH fermentation conditions

谷氨酰胺酶在小麦酱油发酵过程中不断地将L-谷氨酰胺转化为有鲜味的谷氨酸，从而提高小麦酱油的鲜味[9]。不同pH发酵条件下酱油成熟期谷氨酰胺酶活力的变化见图2。发酵液中谷氨酰胺酶活力随发酵天数的增加不断降低。整体而言，pH值为6.5的酱油发酵液中谷氨酰胺酶活力明显高于pH 5.4的发酵液，整体上高约30%。

发酵40天时，pH 6.5的发酵液谷氨酰胺酶活力约为4.5 U/g，逐渐降低至50天的酶活力约为3.8 U/g，经过一段平台期(50～55天)后，谷氨酰胺酶活力迅速下降至70天的约1.0 U/g。pH 5.4的发酵液则由40天的酶活力约3.2 U/g逐步降至70天的酶活力约0.5 U/g。

2.3 不同pH发酵条件下酱油成熟期色泽度的变化

图3 不同pH下酱油成熟期颜色指数Fig.3 Color indexes of maturation period of soy sauce at different pH values

由图3可知，随着发酵时间的不断增加，2种小麦酱油的红色指数、黄色指数变化曲线均呈缓慢上升趋势。从整体上看，发酵pH值稳定在6.5的酱油的红色指数和黄色指数均明显高于不控制pH的酱油。pH 6.5的酱油红色指数达到4.50，黄色指数达到7.40。pH 5.4的酱油红色指数仅为4.10，黄色指数仅为6.90。由此可见，pH 6.5的酱油的红色指数和黄色指数分别较pH 5.4的酱油提高了9.76%和7.25%。这一研究结果与焦糖色素的制备研究结论一致，偏中性pH值有助于提高色素的红色指数和黄色指数[10]。

2.4 不同pH发酵条件下酱油成熟期总糖和还原糖的变化

图4 不同pH下酱油成熟期总糖和还原糖的变化规律Fig.4 Variation of total sugar and reducing sugar in the maturation period of soy sauce at different pH values

由图4可知，pH 6.5的酱油在成熟期总糖含量、还原糖含量均呈逐渐下降的趋势，pH 5.4的酱油趋势基本与pH 6.5的酱油保持一致。pH 5.4发酵条件下的酱油总糖含量从40天时的约12.5 g/dL逐渐降低为70天时的约11.5 g/dL。pH 6.5发酵条件下的酱油总糖含量在整个成熟期发酵过程中均低于pH 5.4的酱油，70天时总糖含量约为10.6 g/dL。对于还原糖含量，2种酱油均在40～45天略微上升，发酵达45天时，pH 6.5的酱油达到约7.2 g/dL，pH 5.4的酱油则达到约8.2 g/dL。45～70天2种酱油的还原糖含量逐渐减少， pH 6.5的酱油还原糖减少趋势更强，pH 6.5的酱油约为6.3 g/dL，pH 5.4的酱油约为7.8 g/dL。

2.5 不同pH酱油发酵70天后总氨基酸和游离氨基酸组成分析

表2不同pH酱油发酵70天后游离氨基酸和水解氨基酸组成分析
Table 2 Composition analysis of free and hydrolyzed amino acids after 70 days' fermentation in soy sauce with different pH values

mg/mL

续 表

由表2可知，发酵达到70天后， pH 5.4发酵条件下的酱油中游离氨基酸略高于pH 6.5的酱油，这与图1中b中所示酱油中氨基酸态氮含量对比一致。pH 6.5发酵条件下的小麦酱油中鲜味类氨基酸含量为25.72 mg/mL，比pH 5.4的酱油中鲜味类氨基酸高约33.9%。其中，谷氨酸的差异明显，pH 6.5的谷氨酸含量达23.29 mg/mL，明显高于pH 5.4酱油的16.78 mg/mL。与之对应，pH 6.5的酱油中游离谷氨酰胺含量较pH 5.4的显著下降，表明谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下水解为谷氨酸。pH 6.5的酱油中甜味类游离氨基酸达29.81 mg/mL，比pH 5.4的酱油低约24.41%，主要原因是pH 5.4的酱油中呈甜味的谷氨酰胺被大量水解为鲜味氨基酸。2种pH值发酵酱油在苦味类和无味类游离氨基酸上无明显差异。

与2种酱油游离氨基酸组成差异较大不同的是，2种酱油的总氨基酸差异较小，均富含谷氨酸、脯氨酸，这与小麦面筋蛋白的氨基酸组成特点一致[11]。

2.6 不同pH酱油发酵70天后肽分子量分布

表3 不同pH酱油发酵70天后肽分子量分布情况Table 3 Molecular weight distribution of peptides after 70 days' fermentation in soy sauce with different pH values

由表3可知，2种小麦酱油在不同肽段的分子量分布大致相同，但总体而言，pH 6.5酱油的分子量略大于pH 5.4的酱油。具体来看，2种小麦酱油中<1 kDa和1～3 kDa肽段均占主体，超过50%肽段处于这一区间内，这与小麦酱油游离氨基酸和寡肽含量较高有关。其中<1 kDa的肽段，pH 5.4的酱油所占比例为34.02%，略高于pH 6.5的酱油；但在1～3 kDa肽段，pH 5.4的酱油所占比例为20.36%，明显低于pH 6.5的酱油。此外，pH 5.4的酱油中3～5 kDa和5～10 kDa肽段均高于pH 6.5的酱油，而>10 kDa肽段低于pH 6.5的酱油。

2.7 酱油的感官评价

图5 不同pH条件下酱油发酵70天的感官评价Fig.5 Sensory evaluation of soy sauce fermentation for 70 days under different pH conditions

由图5可知，不同pH发酵条件下得到的小麦酱油滋味有明显差异。相比于自然pH发酵的酱油，pH 6.5条件下发酵的酱油鲜味更强，这与其含有更多的谷氨酸有关。二者在咸味上无明显差异，但pH 6.5小麦酱油的苦味更强，自然发酵酱油则在甜味、酸味上更强。pH 6.5小麦酱油的苦味更加强烈，原因不明。

3 结论

将小麦酱油的pH值稳定在6.5，导致酱油的总氮和氨基酸态氮含量略有下降，但酱油中游离谷氨酸含量上升38.56%。

将小麦酱油的pH值稳定在6.5，导致酱油的红色指数和黄色指数分别提高9.76%和7.25%。

将小麦酱油的pH值稳定在6.5，导致酱油的分子量整体偏低，但1～3 kDa肽段含量高于pH 5.4的酱油。

感官评价表明：将小麦酱油的pH值稳定在6.5，导致酱油的鲜味和苦味更强，不调节pH值的酱油则在甜味、酸味上更强。