何江红，王荣钰，2，舒小芳，赵洁，卢雪松*

(1.四川旅游学院，成都 610100；2.四川理工学院，四川 自贡 643000)

酸肉是我国西南少数民族地区传统的发酵肉制品，以猪肉、鱼肉为原料，辅以玉米粉、米粉或青稞粉及多种调味料在自然条件下经厌氧发酵而成，品种主要分为三大类：湖南湘西地区侗族传统酸肉、贵州荔波传统酸肉、川西藏区臭肉[1-3]。国内外有关酸肉的报道主要针对发酵肉的生产工艺、发酵条件、发酵风味形成及风味变化[4-6]。李华丽等人研究了盐浓度、葡萄糖浓度、发酵时间和发酵温度对酸肉pH值的影响，确定了酸肉在自然发酵下的最佳发酵条件，说明了发酵肉制品的优越性[7，8]。竺尚武等人对金华火腿中的挥发性风味物质进行了研究，得出经过长期的腌制和成熟过程,肌肉蛋白和脂肪在蛋白酶和脂肪酶的作用下,产生大量更易于消化吸收的多肽、游离氨基酸、游离脂肪酸等物质,并形成大量的挥发性化合物,赋予腌制肉品独特的香气[9-11]。

传统酸肉是采用多菌种混合自然发酵，菌种主要来源于原材料以及自然环境。由于自然状态下，微生物的种类与生理特性因环境条件的影响极大，因此传统发酵技术难以控制酸肉的食用品质与安全问题，阻碍了酸肉的工业化、规模化生产。目前已有学者对酸肉制品的优势菌种进行筛选及鉴定[12-16]，李宗军等人还发现酸醡肉的优势菌群主要为乳酸菌、微球菌及酵母菌。周才琼等对渝黔苗汉杂居地区传统酸肉有关微生物区系和营养特性进行了研究，研究表明发酵可以提高酸肉蛋白质营养价值。陈曦、周彤等人从贵州酸肉中筛选出具有高亚硝酸盐降解和耐受能力的乳酸菌。杜斌、李苗苗等人从贵州传统酸肉、腌鱼中筛选鉴定出可降解胆固醇的乳酸菌，为传统酸肉制品的保健功能作用提供了研究基础。众多研究表明，微生物的种类与特性是酸肉发酵过程中的关键因素之一，其为酸肉提供了良好的风味，改变了肉质的组织性状，有效抑制了有害物质产生，且缩短了发酵周期。

牦牛是高寒地区的特有牛种，属于草食性反刍家畜，半野生放牧的饲养方式，牦牛肉富含蛋白质和氨基酸以及胡萝卜素、磷、钙等微量元素，但因其饲养周期长，肉膻味重，肉质粗老，口感坚韧，硬度较大，对产品加工产生了极大的阻碍与限制[17，18]。从川西藏区扎坝臭猪肉加工中获取灵感，并借鉴川渝地区传统酸醡肉的发酵工艺，研发了牦牛酸醡肉，并研究了该产品在不同烹饪方式下的食用品质[19]。现阶段牦牛酸醡肉加工技术尚属于自然发酵。在牦牛酸醡肉发酵过程中，微生物所产生的蛋白酶和淀粉酶作用于牦牛肉和青稞粉，改善牦牛肉粗老的肉质，同时又能赋予产品以特殊风味[20，21]。但对于川西藏区牦牛酸醡肉自然发酵过程中微生物特性研究的相关报道尚属空白。本实验从牦牛酸醡肉中分离产蛋白酶和产淀粉酶的菌株，对其进行产酶活性和生理特性研究，经基因测序，确定目标菌。后期可将目标菌应用到牦牛酸醡肉发酵剂研发中。以期为后续牦牛酸醡肉实现工业化、规模化、规范化生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牦牛肉：符合GB 18393—2001《牛羊屠宰产品品质检验规程》，实验当天购自四川省甘孜州白玉县综合农贸市场。实验室自制40目炒青稞全粉，由甘孜州农科所八美农场提供的康青8号(2016，2017年产)。小西瓜白砂糖：北京厨大妈食品集团有限公司；绿色生态盐：四川久大制盐有限公司；窝窝醪糟：成都巨龙生物科技有限公司；干辣椒、辣椒粉、花椒粉、生姜、大葱、蒜、八角粉：购于成都市龙泉驿区平安菜市。

培养基配方药品 北京奥博星生物科技有限公司；可溶性淀粉 成都市科隆化工试剂厂；蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、乳酸石碳酸棉蓝染液、酪蛋白、酪氨酸、结晶紫 天津市致远化学试剂有限公司；过氧化氢、95%乙醇 国药集团化学试剂有限公司。所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SHP0201147047型电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司；SW-CJ-IF型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；LRH-250型生化培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；QYC-2102C型摇床 上海福玛实验设备有限公司；DHG-9140型电热恒温干燥箱 上海三发科技仪器有限公司；YX-280立式压力蒸汽灭菌器 上海三申医疗器械有限公司；BH200微生物显微镜 宁波舜宇仪器有限公司；722S型分光光度计 无锡天牧仪器科技有限公司；HHS-8S型恒温水浴锅 上海光地仪器有限公司。

1.3 方法[22-28]

1.3.1 样品制备

根据国家发明专利201610348936.2所提供的加工方法进行制作：(1)将晒干后干净的青稞翻炒并进行打粉，获得炒青稞粉；(2)将牦牛肉洗净剔除筋腱，切块备用；(3)按比例将炒青稞粉、辣椒粉、花椒粉、香辛料、酒酿、姜末、白糖和食盐混合，均匀涂抹在牦牛肉上，于密闭容器中发酵。

1.3.2 菌株分离

参照GB 4789.2—2016提供的方法对发酵过程中的牦牛酸醡肉进行取样制样，利用选择培养基筛选出芽孢杆菌、乳酸菌、真菌。

1.3.3 产酶菌株筛选

1.3.3.1 产蛋白酶菌株筛选

将分离纯化后的菌株接种到对应产蛋白酶筛选培养基中，36 ℃培养48 h后观察菌株周围是否有蛋白酶水解圈，若有，即判定该菌株具有产蛋白酶活性。

1.3.3.2 产淀粉酶菌株筛选

将分离纯化后的菌株接种到对应淀粉培养基平板上，36 ℃培养48 h后将碘液滴加菌落上，有透明水解圈的菌落即判定该菌有产淀粉酶活力。

1.3.4 产酶活性测定

1.3.4.1 产蛋白酶活力

参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》提供的方法测定。

1.3.4.2 产淀粉酶活力

参照提供的淀粉酶活力测定方法测定。

1.3.5 形态学鉴定

1.3.5.1 菌落形态观察

按无菌操作将各个菌株接种于对应的固体培养基，36 ℃培养48 h，观察菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度等，做好记录。

1.3.5.2 个体形态观察

按微生物指导书中革兰氏染色法对各菌株染色，辨别其为阳性菌或是阴性菌[29]，并在100倍油镜下观察其菌体形态、大小、有无芽孢及其着生位置等，毛霉菌采用乳酸石碳酸棉蓝染色。严谨观察、描述、拍照、记录。

1.3.6 生理特性研究

产过氧化氢酶活性；糖类发酵实验；乳酸菌产酸能力测定。

1.3.7 菌株基因序列测定

以活化后的目的菌株菌落为模板，细菌按照DP302试剂盒提取DNA，进行PCR扩增16S rDNA片段，引物为细菌16S rDNA通用引物，引物序列如下：

27F：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

真菌按照DP336试剂盒提取DNA，进行PCR扩增ITS片段，引物为真菌ITS通用引物，引物序列如下：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

PCR体系为25 μL：27F和1492R各1 μL，PremixTaq酶12.5 μL，DNA模板适量，灭菌双蒸水补足体系25 μL。

PCR反应程序：预变性95 ℃ 8 min，变性95 ℃ 45 s，复性55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 2 min，25个循环，补充延伸72 ℃ 10 min，保存于12 ℃ 5～10 min。

PCR产物经核酸电泳检测后,送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，将所测定菌株的序列同GenBank中已提交的序列进行B1astN分析和同源比对，确定菌株种属，再利用MEGA 5.05构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

选择培养基，从牦牛酸醡肉中共分离纯化得到乳酸菌11株、芽孢杆菌10株、真菌17株(不排除同种菌)，一一编号，保存于4 ℃冰箱备用。

2.2 产酶菌株的筛选

经产蛋白酶活性筛选，共有7株菌有产蛋白酶能力，其中有2株乳酸菌，2株真菌，3株芽孢杆菌，分别编号为R1，R2，Z1，Z2，Y1，Y2，Y3；经产淀粉酶活性筛选，共有3株菌有产淀粉酶能力，且均为具有产蛋白酶能力的芽孢杆菌，即为Y1，Y2，Y3，详细结果见表1。

表1 产蛋白酶能力Table 1 Protease producing ability

2.3 产酶活性分析

2.3.1 产蛋白酶活性

表2 菌株产蛋白酶活力Table 2 The protease-producing abilities of the strains

注：数据中标注不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图1 各菌株产蛋白酶活力对比Fig.1 Comparison of protease production capacity of each strain

由表2和图1可知，各种菌产蛋白酶活力差异显著(P<0.05)，其中芽孢杆菌Y1，Y2，Y3产蛋白酶活力最佳，其次是乳酸菌R1和R2，Z1产蛋白酶活力最差。

2.3.2 产淀粉酶活性

三株芽孢杆菌产淀粉酶活力差异显著(P<0.05)，其中Y1最强，其次是Y2，Y3产酶活力较弱，见表3和图2。

表3 菌株产淀粉酶活性Table 3 The ability of the strain to produce amylase

注：数据中标注不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图2 各菌株产淀粉酶活力对比Fig.2 Comparison of amylase production capacity of each strain

2.4 形态学鉴定

对分离出的7株产蛋白酶菌株的菌落形态进行观察鉴定。通过革兰氏染色和霉菌的乳酸石碳酸棉蓝染色，观察菌株的个体形态，并确定有6株菌为革兰氏阳性菌，观察结果见表4。

表4 形态描述Table 4 Morphological description

2.5 生理特性分析

生理生化特征分析结果见表5，参照伯杰细菌鉴定手册，菌株R1，R2，Y1，Y2，Y3，Z1，Z2的生理特性和植物乳杆菌、戊糖片球菌、淀粉液化芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌亚种、镰刀霉、黑曲霉的基本特征相吻合。根据结果可知7株菌株都具有良好的分解糖类的能力，其中葡萄糖、蔗糖和麦芽糖所有菌株均能分解，具有糖酵解能力是发酵菌所必须需能力。此外，2株乳酸菌也具有良好的分解乳糖的能力，它们不仅能利用来自青稞的糖分，同时也能利用来自牦牛肉的糖分进行发酵，属于优质发酵菌。

表5 生理特性分析Table 5 Physiological analysis

对2株乳酸菌产酸能力的测定结果见表6，R1和R2均具有较好的产酸能力，能有效地降低发酵体系的pH，从而产生酸醡肉特有的酸味，并且其产生的酸性环境能有效地抑制其他杂菌的侵染，防止发酵过程发生腐败。对比2株乳酸菌的产酸能力可知，R1产酸能力优于R2，因此在实际发酵剂的配制过程中，可根据目标产品的风味要求调整2种菌株的使用配比。

表6 乳酸菌产酸能力Table 6 The acid-producing ability of lactic acid bacteria

2.6 基因序列测定

根据1.3.7的方法步骤，处理筛选到的2株乳酸菌、3株芽孢杆菌和2株真菌，得到相应菌株的16S rDNA序列和ITS序列，将各个菌株序列在CNBI基因库中进行同源性比较，获得和各菌株序列相似度最高的菌株，即认定该菌株种类，具体结果见表7，发育树见图3和图4。

表7 基因测序结果Table 7 Gene sequencing results

图3 细菌发育树Fig.3 Bacterial growth tree

图4 真菌发育树Fig.4 Mycogenetic growth tree

3 结论

本实验从自然发酵的牦牛酸醡肉中分离出了7株菌(R1，R2，Y1，Y2，Y3，Z1，Z2)，所有菌均具有产蛋白酶活力，其中Y1，Y2，Y3还具有产淀粉酶活力。通过基因测序测定为植物乳杆菌、戊糖片球菌、淀粉液化芽孢杆菌、多粘类枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌亚种、镰刀霉、黑曲霉。根据其各自产酶分析，得出其中产蛋白酶能力最强的是淀粉液化芽孢杆菌(108.7 U/mL)、多粘类枯草芽孢杆菌(102.75 U/mL)、枯草芽孢杆菌亚种(103.89 U/mL)，其中植物乳杆菌(71.81 U/mL)和戊糖片球菌(75.81 U/mL)也具有较强的产蛋白酶能力；产淀粉酶活性测定结果指出，其产淀粉酶活力分别为淀粉液化芽孢杆菌(74 U/mL)、多粘类枯草芽孢杆菌(64 U/mL)、枯草芽孢杆菌亚种(40 U/mL)。3株芽孢杆菌同时具有产蛋白酶和产淀粉酶活性能充分利用作为发酵粉的青稞中的淀粉进行发酵，属于优质发酵菌。目前，产蛋白酶微生物以芽孢杆菌和霉菌为主，而本实验筛选出的2株乳酸菌同样有着较强的产蛋白酶能力，值得进一步的研究开发。