高绍金，李志江，赵家圆，韩齐，李艳青

(黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319)

鲁氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)是传统豆酱、酱油生产过程中能够产生风味的微生物，耐盐性强；产醇类、糖醇类及呋喃酮类风味物质，并与乳酸曲的代谢产物发生反应[1]，利于香气的形成；能将谷氨酰胺酶转化为底物生成谷氨酸，增强鲜味，对发酵后熟阶段中香气成分的产生具有至关重要的作用[2]。

发酵香肠是指以碎肉、脂质为主要原料，与盐、糖、味精、香料及微生物发酵剂等混合腌制后灌进肠衣，在一定条件下发酵而成的发酵肉制品[3-6]。发酵香肠中常用的发酵剂菌株是乳酸菌、接触酶阴性球菌(主要是葡萄球菌属和考克斯菌属)以及酵母和霉菌[7]。发酵香肠不仅风味特殊，食用方便，还含有多种有益于人体的营养成分，自20世纪以来，国内对发酵香肠的研究便备受瞩目，发酵剂种类日益更新，由单一的微生物发酵剂到复合发酵剂[8]。复配发酵剂是直投式发酵剂的一种，通过优势菌的作用，在不改变发酵品质的基础上，成功克服了微生物发酵剂的不足，从而改善了发酵剂的性能[9,10]。

虽然各种发酵剂菌株在发酵香肠中已有广泛的应用，但鲜有将鲁氏酵母加入发酵香肠中，并研究其对发酵香肠中品质影响的相关报道。因此，将鲁氏酵母菌加入发酵香肠中，探究其是否能够提高发酵香肠的风味，是否具有增鲜增香的作用，将对鲁氏酵母的开发提供良好的基础，为生产新型发酵食品提供依据。本研究通过菌种的耐酸性、耐食盐能力、耐亚硝酸盐能力、生长温度和最适生长温度等试验，对其发酵生产性能进行测定，同时，通过吲哚试验、溶血试验及药敏试验，确定菌种的安全性能。判断其是否符合应用于发酵肉制品的要求，以便生产出新型发酵肉制品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验原料

YPD液体培养基、血琼脂平板、蛋白胨水培养基、Kovacs氏靛基质试剂盒、药敏纸片(诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、红霉素、阿莫西林、氨苄西林和链霉素)、氯化钠(NaCl)、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、亚硝酸钠(NaNO2)等常规化学试剂，均购于大庆市博微生物试剂有限公司。

1.1.2 菌种来源

鲁氏酵母菌(编号：32899)：中国工业微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌：均为黑龙江八一农垦大学微生物实验室分离纯化菌种。

1.1.3 仪器设备

MET-TLERAE 100型分析天平 沈阳龙腾电子称量仪器公司； SW-CJ-1 FD型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；THZ-82 A型水浴恒温振荡器 金坛市荣华仪器制造有限公司；HZQ-QX型全温振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；SHP-250型生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；TU-1800紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 鲁氏酵母的活化及培养

挑取鲁氏酵母冻干粉进行活化，将100 mL灭菌YPD液体培养基在无菌工作台中倒入菌粉，放入全温振荡器中，28 ℃、180 r/min条件下培养，培养3天。将5 mL已活化的菌液加入100 mL培养基中，放入全温振荡培养箱中，28 ℃、180 r/min，培养30 h。

1.2.2 鲁氏酵母的发酵生产性能研究

1.2.2.1 不同酸度对鲁氏酵母菌生长的影响

利用比浊法的原理，用光密度值(OD值)的变化来判断菌株存活情况。根据朗伯比尔定律OD=logItIO=kbc，c表示样品浓度，若样品液厚度b一定，则OD值与样品的浊度相关[11]。将活化好的菌种菌液以1%的接种比例，分别加入用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调pH值(3，4，5，6，7)的灭菌YPD液体培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h后，将菌液稀释至合适倍数(使吸光值在0.1～0.8之间)，在波长600 nm处测量吸光度值，每组试验做3组平行。

1.2.2.2 不同食盐浓度对鲁氏酵母菌生长的影响

将活化好的菌种菌液以1%的接种比例，加入不同盐浓度(0，2%，4%，6%，8%，10%)的灭菌YPD液体培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h后，测吸光度值，做3组平行试验。

1.2.2.3 不同亚硝酸盐浓度对鲁氏酵母菌生长的影响

将活化好的菌种菌液以1%的接种比例，加入不同NaNO2浓度(0，50，100，150，200 mg/kg)的灭菌YPD液体培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h后，于波长600 nm处测量吸光度值，做3组平行试验。

1.2.2.4 不同温度对鲁氏酵母菌生长的影响

将活化好的酵母菌悬液按一定量接种至YPD液体培养基中，置于25，28，30，35，40 ℃，于180 r/min振荡培养48 h后，于波长600 nm处测量吸光度值，做3组平行试验。

1.2.3 鲁氏酵母的安全性研究

1.2.3.1 吲哚试验

将3%活化好的鲁氏酵母菌株接入到蛋白胨水培养基中，在28 ℃培养72 h，滴入吲哚3～4滴试剂，观察试验结果。同时用大肠杆菌做阳性对照，并做空白试验。

1.2.3.2 溶血试验

将活化好的鲁氏酵母菌株用接菌环划线和穿刺于血琼脂平板中，28 ℃培养48 h，观察有无溶血圈出现。同时用金黄色葡萄球菌做阳性对照，并做空白试验。

1.2.3.3 药敏试验

分别吸取1 mL(约1×108cfu/mL)供试菌株菌液于15 mL YPD固体培养基(50 ℃)中，混匀后倾倒至灭菌培养皿中，待培养基凝固后，用无菌镊子将药敏纸片紧贴于琼脂表面。室温放置1 h，然后将平皿置于28 ℃恒温培养箱中倒置培养，24 h后测量并记录抑菌圈直径，每种抗生素做3组平行。分离菌株敏感性参照CLSI的最新版本标准进行判定[12]。

1.3 统计分析

数据用Statistix 8.0软件进行统计分析，利用SigmaPlot 12.5进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 鲁氏酵母菌生长曲线

微生物的生长曲线代表该微生物在新的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化，一般分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期4个阶段。鲁氏酵母菌生长的标准曲线见图1。

图1 鲁氏酵母生长标准曲线Fig.1 Growth curve of Zygosaccharomyces rouxii

由图1可知，在刚接种鲁氏酵母时，测其吸光度值为0，说明此时鲁氏酵母还未生长；在培养时间为0～48 h时，随着培养时间的增加，测得的鲁氏酵母的吸光度值越来越大，直到培养48 h时吸光度值最大；在培养36～72 h时，吸光度值在0.6～0.9，而此时的生长曲线呈对数增长，说明鲁氏酵母菌在此时生长最旺盛。

2.2 鲁氏酵母的发酵生产性能研究

2.2.1 不同酸度对鲁氏酵母菌生长的影响

酵母菌通常与乳酸菌复配成复合发酵剂应用于发酵肉制品中，因此酵母菌必须适应乳酸菌所造成的酸性环境[13]。在发酵过程中，pH在4.8～5.0时对致病菌及腐败菌的抑制效果最好，可加快发酵香肠色泽、风味的形成，减少蛋白质的束水能力以保证干燥，因此，需测定鲁氏酵母在不同pH下的生长情况。

图2 不同酸度对鲁氏酵母菌生长的影响Fig.2 Effect of different acidity on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由图2可知，鲁氏酵母菌在pH为3时仍能较好存活；在pH为4～6的酸性环境中生长良好，在此期间，随着pH的增加，生长越来越旺盛。故而说明鲁氏酵母菌能够在酸性环境下稳定生长，符合作为发酵剂的标准。

2.2.2 不同食盐浓度对鲁氏酵母菌生长的影响

相关资料显示，腌制发酵香肠时，通常添加2%左右的食盐，但随着发酵过程的进行，香肠内部水分含量会逐渐减少，食盐浓度会逐步升高，在一般的发酵香肠中，食盐含量可达到5%。因此，欲将鲁氏酵母菌作为发酵剂应用于发酵香肠中，必将考虑其对食盐的耐受能力，本试验测定鲁氏酵母菌的最大食盐耐受浓度为6%。

图3 不同食盐浓度对鲁氏酵母菌生长的影响Fig.3 Effect of different salt concentration on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由图3可知，添加食盐浓度对鲁氏酵母菌的生长影响较大，食盐浓度越高，抑制越明显。在食盐浓度为2%时，鲁氏酵母的生长未发生明显变化；当食盐浓度为4%～6%时，吸光度值有缓慢降低趋势，但仍处于良好状态；食盐浓度达到8%时，吸光度值下降明显，鲁氏酵母菌的生长趋于缓慢。因此，鲁氏酵母菌能够耐受6%的食盐浓度，就此项指标而言，其可作为发酵剂使用。

2.2.3 不同亚硝酸盐浓度对鲁氏酵母菌生长的影响

亚硝酸盐作为重要的食品添加剂，对发酵香肠的生产有着密不可分的作用。在香肠的发酵过程中，利于颜色和腌腊制品特殊风味和质构的产生；对于在肉制品中危害较大的致病菌有显著抑制其生长繁殖的作用[14-17]，确保产品的生物安全性。对于食品中亚硝酸盐的添加量我国有着严格的规定，不得超过30 mg/kg；而用来生产肉品发酵剂的微生物一般要求可耐受100 mg/kg的亚硝酸盐浓度，因此本试验测定的最大亚硝酸盐浓度为200 mg/kg。

图4 不同亚硝酸盐浓度对鲁氏酵母菌生长的影响Fig.4 Effect of different nitrite concentration on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由图4可知，随着亚硝酸盐浓度的增加，鲁氏酵母菌的生长受到不同程度的抑制。当亚硝酸盐浓度为0.005%时，鲁氏酵母菌的吸光度值骤然下降，生长速度明显迟缓；亚硝酸盐浓度达到0.015%时，鲁氏酵母菌仍保持一定程度的生长；当亚硝酸盐浓度升高至0.020%时，吸光度值明显小于0.6，处于生长滞缓阶段。由此说明，鲁氏酵母菌具有较高的耐受亚硝酸盐能力，可作为发酵香肠的发酵剂使用。

2.2.4 不同温度对鲁氏酵母菌生长的影响

发酵香肠的发酵温度通常为25～28 ℃，为了保证作为发酵剂的酵母菌能够在生产条件下良好生长，菌株的最佳生长温度须符合此温度范围。

图5 不同温度对鲁氏酵母菌生长的影响Fig.5 Effect of different temperatures on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由图5可知，鲁氏酵母菌在25 ℃时生长处于旺盛阶段；在28 ℃时生长最旺盛，此后随温度升高，吸光度值降低，生长缓慢，35 ℃时生长迟缓，由此可见，鲁氏酵母菌在25～32 ℃之间生长旺盛，最适生长温度为28 ℃，符合作为发酵剂的要求。

2.3 鲁氏酵母的安全性研究

2.3.1 吲哚试验

吲哚试验能够检测菌株能否分解到蛋白质中的色氨酸。色氨酸是人体内的必需氨基酸之一，可以参与人体内蛋白质合成，调节免疫功能，具有促进消化吸收的作用[18]。如果待测菌株吲哚试验呈阳性，则说明该菌株能分解色氨酸，从而引起人体代谢障碍。

图6 鲁氏酵母菌吲哚试验结果Fig.6 Results of indole test of Zygosaccharomyces rouxii

注：1为未添加菌种；2～4为添加鲁氏酵母；5为添加大肠杆菌。

向培养好的菌液中滴加指示剂后，空白对照组与鲁氏酵母菌的3组平行试验均未出现红色圆环，而大肠杆菌中出现红色圆环，由图6可知，鲁氏酵母菌的吲哚试验结果呈阴性，大肠杆菌的吲哚试验结果呈阳性。吲哚试验结果表明，鲁氏酵母菌不会分解色氨酸产生吲哚类物质。

2.3.2 溶血试验

溶血是指红细胞破裂溶解现象，可由多种理化因素和毒素引起[19]。如果发酵食品所用微生物具有溶血现象，会对人体造成一定危害，因此有必要在使用前对其进行溶血试验。

图7 鲁氏酵母菌溶血试验结果Fig.7 The results of hemolytic test of Zygosaccharomyces rouxii

注：1为未接种菌种；2～4为接种鲁氏酵母菌；5左侧为接种鲁氏酵母菌，右侧为接种金黄色葡萄球菌。

由图7可知，在培养的鲁氏酵母菌周围的琼脂未显示绿色，同时并未出现透明圈，说明没有产生α-溶血和β-溶血现象，而金黄色葡萄球菌周围则显示透明溶血圈；实验结果说明，本试验所用的鲁氏酵母菌无溶血现象发生，说明菌株不是溶血细菌，具有食用安全性。

2.3.3 药敏试验

采用K-B纸片扩散法测定了鲁氏酵母菌对7种抗生素的抗药性情况，测定结果见表1。菌株对抗生素产生的抑菌圈直径均在质控范围内，因此，试验测得的数据为真实结果。

表1 鲁氏酵母菌的抑菌圈直径及抗性结果Table 1 Diameter of bacteriostatic circle and antibiotic resistance results of Zygosaccharomyces rouxii

注：抑菌圈直径以平均值±标准差的形式表示；供试菌株对某种抗生素敏感(susceptible)用S表示，中度敏感(intermediate)用I表示，抗性(resistant)用R表示。

由表1可知，鲁氏酵母菌对红霉素(大环内酯类药物)、氨苄西林(青霉素类药物)、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星(喹诺酮类药物)以及链霉素(氨基糖苷类药物)敏感，对阿莫西林有抗性，说明鲁氏酵母可安全用于肉品发酵剂。

3 结论

目前，国内外关于发酵肉制品的研究始终都是热门，关于各种微生物菌群的开发及综合使用等相关研究更是层出不穷。国内的众多研究者研究微生物发酵剂时，大多关注于细菌的相关研究，如乳酸菌、微球菌、葡萄球菌等，也有些研究者将具有改善发酵肉制品风味及促进颜色等作用的酵母菌定为研究方向，将其配合乳酸菌等微生物作为发酵剂使用。

本研究通过菌种的耐酸性、耐食盐能力、耐亚硝酸盐能力、生长温度和最适生长温度等试验，对其发酵生产性能进行测定，同时，通过吲哚试验、溶血试验及药敏试验，确定菌种的安全性能，判断其是否符合应用于发酵肉制品的要求。试验结果显示，鲁氏酵母菌在pH为4～6的培养条件下可良好生长；耐受6%的食盐浓度和150 mg/kg的亚硝酸盐；在25～32 ℃均能较好生长，在28 ℃生长情况最佳；在培养过程中，鲁氏酵母菌不会产生吲哚类物质，亦不属于溶血细菌；对红霉素、氨苄西林、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星以及链霉素敏感，对阿莫西林有抗性。综上所述，鲁氏酵母菌的各项生产安全性能符合作为发酵肉制品的要求，可考虑与乳酸菌复配成复合发酵剂应用于发酵香肠或其他发酵产品的生产，起到稳定生产、提高产品品质的作用。