金成武，杜林晓，陈鑫，张悦，张斯程，刘文丽，孙舒扬

(鲁东大学 食品工程学院，山东 烟台 264025)

泡菜是我国传统特色发酵食品的代表，它是以白菜、萝卜等蔬菜为主要原料，经过乳酸菌群协同发酵制成的一种发酵类食品[1,2]。泡菜口感清爽、味道鲜美，含有多种维生素及矿物质，可促进人体内肠胃蠕动、助消化，还具有降低人体内胆固醇含量的作用。乳酸菌是泡菜生产过程中的优势菌，在泡菜的整个发酵过程中非常重要，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmensenteroides)和短乳杆菌(L.brevis)是其中最主要的乳酸菌种[3,4]。

传统的泡菜制作方式都是采用自然发酵法，发酵周期较长，产品质量不稳定，亚硝酸盐含量也较高[5]。亚硝酸盐的生成和积累极大地影响了泡菜的食用安全性，因为亚硝酸盐在酸性条件下能与胺类及氨基酸等含氮化合物反应，生成具有致癌作用的亚硝胺和亚硝酰胺[6，7]。亚硝酸盐的生成主要在泡菜发酵初期，随着发酵时间的延长，亚硝酸盐的含量也会逐渐降低。但是工业化生产为了提高生产效率，往往缩短发酵周期，亚硝酸盐可能仍维持在较高的浓度。因此，筛选降解亚硝酸盐能力强且生长速率快的乳酸菌菌株对泡菜的生产和推广应用十分重要。

本研究以市售泡菜为研究对象，从中筛选出乳酸菌，研究其基本生理生化特性、产酸性能、降解亚硝酸盐的能力以及耐酸性，进而筛选出各方面性能都比较优异的乳酸菌株，并对其采用API 50 CHL碳水化合物的发酵产酸试验及分子生物学技术进行鉴定。本研究可以丰富乳酸菌菌种资源，并为其在食品工业中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

购买市售泡菜11种，产地包括烟台、青岛、广州、北京和成都。

1.2 培养基

改良MRS培养基(1 L)：葡萄糖20 g，酵母粉5 g，牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，蛋白胨5 g，吐温80 1 g，柠檬酸三铵 2 g，磷酸二氢钾2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.1 g，硫酸锰0.05 g；pH 6.0，121 ℃灭菌20 min。

1.3 试剂

胰蛋白胨、乙酸钠、牛肉浸膏：国药集团化学试剂有限公司；引物、PCR Master Mix、细菌基因组提取试剂盒：天根生化科技有限公司；革兰氏染色液：南京建成科技有限公司；其他试剂：均为分析纯。

1.4 仪器

生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；XSP-BM-2CA生物显微镜 上海彼爱姆光学仪器制造有限公司；离心机 上海安亭科学仪器厂；PCR扩增仪 杭州博日科技有限公司；DYY-10C型电泳仪 北京市六一仪器厂；Gel Doc XR凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；FE20K pH计 瑞士梅特勒-托利多公司；Cary60紫外可见分光光度计 美国Agilent公司。

1.5 试验方法

1.5.1 泡菜样品中乳酸菌的分离纯化

向10 g泡菜中加入90 mL无菌水，充分振荡，采用梯度稀释进行稀释，稀释度为101～108。吸取0.2 mL稀释液涂于含有0.5% CaCO3的改良MRS固体培养基上，30 ℃厌氧箱中培养2～5天，观测菌落形成情况。选取有钙圈生成的菌落，挑取单菌落，反复进行划线分离直至获得纯菌落。

1.5.2 乳酸菌的初步确定及形态学观察

挑取纯化后的菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶接触试验。革兰氏染色呈现阳性且过氧化氢酶呈现阴性初步判断为乳酸菌，通过革兰氏染色镜检图片记录乳酸菌形态特征。

1.5.3 菌液pH 测定

乳酸菌菌株在改良MRS液体培养基中于30 ℃培养24 h，用pH计测定菌液pH值并记录。

1.5.4 降解亚硝酸盐能力测定

亚硝酸盐含量采用国标法(GB 5009.33-2010)测定。用改良的MRS液体活化保存的乳酸菌菌株，按0.2%接种量接入含亚硝酸钠100 μg/mL的MRS液体培养基中，于35 ℃培养60 h，每间隔12 h取样，测定发酵液中的亚硝酸盐含量。

1.5.5 耐酸性试验

液体培养的菌株按1%的接种量接种到pH 2.0(HCl调节)的酸性MRS培养基中，30 ℃培养24 h，利用稀释涂布法计数，计算菌株成活率，判断菌株的耐酸性。

1.5.6 糖发酵试验

根据API 50 CHL系统说明书进行操作，将测试菌株于30 ℃分别培养24 h和48 h，而后读取产酸试验结果并进行记录，将结果输入API plus软件，初步判定菌种的种属。

1.5.7 乳酸菌16S rDNA基因序列测定

将筛选的乳酸菌菌株的基因组DNA进行PCR扩增，用1%琼脂糖进行凝胶电泳检测。使用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3')扩增，PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测定的序列通过BLAST在GenBank中进行同源性比较，并将其鉴定到种。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离和筛选

各种泡菜中所分离出的乳酸菌株数见表1。从北京、烟台等4个产地生产的白菜、萝卜、苏子叶、豇豆4类泡菜中共分离出45株类似乳酸菌的细菌，其中，烟台地区市售散装泡菜中获得13株，青岛市售泡菜中得到13株，北京地区泡菜中分离出5株，成都地区商品化泡菜中获得14株。

表1 各种泡菜中所分离出的乳酸菌株数Table 1 The LAB strains isolated from different pickles

续 表

通过革兰氏染色后镜检观察菌体形态，结果显示：其中36菌株为革兰氏阳性，不移动，无芽孢生成。其中，33.3%细胞呈椭圆形或圆形，单个、成对或者成串排布；66.7%为杆菌，杆菌排列方式多样，呈单杆、双杆或多杆并存的形态。再将这36株菌进行过氧化氢酶测试，发现所有菌株均无气泡产生，即为阴性，因此，初步推断该36株菌为乳酸菌。并将该36株菌按照其泡菜编号及发现顺序依次命名。

泡菜中乳酸菌的种类与所用的蔬菜原料、腌制方法及腌制时间有关。商军等从泡萝卜、泡辣椒和泡白菜中分离出11个乳酸菌株，并对各菌株进行初步鉴定，发现不同泡菜中的乳酸菌菌株有明显差异，泡萝卜中以短乳杆菌为主，泡辣椒中以短乳杆菌和片球菌为主，泡白菜中以短乳杆菌和链球菌为主[8]。据报道，在泡菜发酵前期，肠膜明串珠菌和链球菌是优势乳酸菌，这些菌株积累有机酸并形成厌氧环境。进入发酵中后期，植物乳杆菌和短乳杆菌逐渐成为优势菌群，它们能够耐受酸性环境，且不产气[9]。对于本课题而言，市售的各种泡菜原料可能都处于发酵中后期，因此分离出的乳酸菌株以杆菌居多。

2.2 乳酸菌发酵液的pH

将泡菜中分离出的36株乳酸菌在改良的MRS培养基中培养24 h，培养温度为30 ℃，跟踪测定发酵液的pH变化，试验结果见表2。有13株菌的菌液pH在3.5～4.0之间，有16株菌的菌液pH处于4.0～4.5之间。其中菌株Q12的菌液pH值最低，为3.79。总体而言，所测菌液的pH都处在3.5～5.0之间，平均值为3.94，从而证明这36株乳酸菌的产酸性能均较好。

表2 乳酸菌发酵液pH分组统计Table 2 pH values of broth resulting from different LAB strains

2.3 降解亚硝酸盐的菌株的筛选

泡菜制作过程中一般会伴随亚硝酸盐含量的逐步增加，给泡菜带来了安全隐患。乳酸菌能够降解亚硝酸盐是由于其含有亚硝酸盐还原酶，该酶能够作用于亚硝酸盐使之分解产生氨[10,11]。将36株乳酸菌株按1%(V/V)接种量接入含125 mg/L的亚硝酸盐培养液中，30 ℃培养，间隔12 h取样，测定培养液中的亚硝酸盐含量，计算菌株对亚硝酸钠的降解率。

检测结果表明，空白组的亚硝酸盐含量最高，亚硝酸盐降解率仅为22.5%，说明未接种乳酸菌的试验组的降解能力较弱。接种乳酸菌菌株的培养液中的亚硝酸盐含量均有一定程度的下降，降解率在59.1%～99.8%。不同乳酸菌降解亚硝酸盐的能力差别较大，其中活性最强的是Y1、Y4、Q6和Q12，接种这4株乳酸菌的培养液的亚硝酸盐的降解率分别达到98.7%，99.1%，97.9%，99.8%。这4株乳酸菌的菌落形态和细胞形态见表3，亚硝酸盐降解过程见图1。

表3 具有高效亚硝酸盐降解能力的乳酸菌菌落形态和菌体形态Table 3 The colonial and cellular morphology of LAB strains capable of nitrite degradation

图1 4株乳酸菌在MRS培养基中降解亚硝酸盐的进程Fig.1 The nitrite degradation in the MRS medium inoculated with 4 LAB strains

2.4 耐酸性菌株的筛选

乳酸菌进入人体后需要耐受人体的肠道环境才能存活并发挥其益生作用，因此，对于具有乳酸菌而言，不可避免地需要经受胃部消化液——胃酸的考验，因此乳酸菌菌株的耐酸性对于其自身而言非常重要。为考察所筛选菌株的耐酸性，本研究将分离获得的4株乳酸菌进行耐酸性试验。在无菌条件下，用接种针挑取分离菌株的菌落于澄清的pH 2.0的MRS液体培养基中，30 ℃静置培养24 h。检测结果表明，4株乳酸菌各自具有一定的耐酸性，但仍存在较大差异。Y1、Y4、Q6和Q12的成活率分别是21.5%，19.1%，26.5%，44.2%。Q12菌株耐酸性最强，具有应用的潜力。

2.5 糖发酵试验

将筛选到的耐酸性较强的Q12进行糖发酵产酸试验。根据API 50 CHL系统说明书进行操作，将Q12在49 种碳水化合物中分别培养24 h和48 h，观察记录其产酸结果(见表4)，并利用API plus软件对结果进行鉴定。试验结果表明，菌株Q12与植物乳杆菌(66%)和戊糖乳杆菌(34%)的同源性较高。

表4 菌株的API 50 CHL反应结果Table 4 Results of API 50 CHL test reaction

续 表

2.6 16S rDNA序列测定

对菌株Q12的16S rDNA基因进行PCR扩增，获得了基因片段(1479 bp)，见图2。所得扩增产物纯化后测序，输入GenBank中进行同源性比对，结果显示菌株16S rDNA基因片段与植物乳杆菌同源性均达到99.9%以上，由此可判定菌株Q12为植物乳杆菌(L.plantarum)。

图2 PCR扩增电泳图Fig.2 PCR amplified electrophoresis

3 结论

乳酸菌是泡菜中的主要微生物，利用其降解亚硝酸盐的能力可以提高泡菜的食用安全性。本课题从11种市售泡菜中分离获得了多株乳酸菌，通过革兰氏染色、过氧化氢酶活性测定，确定其中36株为乳酸菌。对这36株乳酸菌的产酸能力、亚硝酸盐降解能力和耐酸性进行测试，最终获得了1株既具有良好耐酸性又具有高效亚硝酸盐降解活性的菌株。该菌株对亚硝酸盐的降解率可以达到99.8%，在pH 2.0的MRS培养基中仍可维持44.2%的成活率。随后对该菌株进行生理生化鉴定和分子生物学鉴定，确定该菌株为植物乳杆菌(L.plantarum)。本研究丰富了乳酸菌菌种资源，并为进一步研究泡菜乳酸菌的功能性及机理以及菌株在泡菜中的应用奠定了基础。