张玉娟，张晓明，杨平荣，陈海龙

(甘肃省药品检验研究院化学药品检验研究室，甘肃 兰州 730070)

甘草酸铋散为抗溃疡药，在临床上常用于治疗胃及十二指肠溃疡。其收载于《国家药品标准化药地标升国标第十三册》，主要成分甘草酸铋的含量按干燥品以铋(Bi)计算，应为11.0%～15.0%。甘草酸铋散是由甘草浸膏和次硝酸铋为原料制备得到的，甘草酸是甘草中最主要的活性成分，也是甘草酸铋散的主要功效组分之一[1-7]。然而，原标准[WS-10001-(HD-1267)-2002]缺少对甘草酸的质量控制；且在检验工作中发现滴定终点颜色变化不明显，溶液浑浊，有返红现象，滴定终点无法判断，初步分析儿茶酚紫不是乙二胺四乙酸(EDTA)滴定的专属指示剂，而且酸度对滴定的影响非常大[8-14]。为此，本研究增加了甘草酸的含量测定，方法学考察结果符合药品质量标准分析方法的技术要求[10]；并改进了滴定方法，优化了样品前处理过程，更换了指示剂，结果颜色变化明显，终点易判断，并做了中间精密度及回收率实验[15]，结果均满意，报告如下。

1 材料

1.1 仪器

Ultimate 3000型高效液相色谱仪(Thermo公司)；SX-2.5-12型箱式电阻炉(天津泰斯特仪器有限公司)；万用电炉(北京科伟永兴仪器有限公司)；AE160/AE163型电子分析天平(Mettler公司)。

1.2 药品与试剂

甘草酸铋散(兰州和盛堂制药有限公司，批号：20150701—20150710)；甘草酸铵对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110731-201418)；次硝酸铋原料(铋含量为70.3%)；EDTA滴定液(0.05 mol/L)；乙腈为色谱纯，试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 甘草酸的含量测定

2.1.1 色谱条件及系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钾溶液(取1.70 g磷酸二氢钾及0.25 g庚烷磺酸钠，用水溶解并稀释至1 000 ml，摇匀)-乙腈(V∶V=72 ∶28)为流动相；检测波长为250 nm；流速为1.0 ml/min；柱温为35 ℃；进样量为10 μl。理论塔板数按甘草酸峰计算≤2 000，甘草酸与相邻峰的分离度应符合要求。

2.1.2 供试品溶液的制备：取本品约0.1 g，精密称定，置于100 ml容量瓶中，加甲醇-水(V∶V=1 ∶1)适量，超声(频率：40 kHZ,功率：150 W)30 min，取出，放冷，用甲醇-水(V∶V=1 ∶1)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备：精密称取甘草酸单铵对照品约20 mg，置于50 ml容量瓶中，用甲醇-水(V∶V=1 ∶1)溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。精密量取适量，用甲醇-水(V∶V=1 ∶1)制成每1 ml含甘草酸单铵盐40 μg的对照品溶液。

2.1.4 色谱柱的适用性：分别采用资生堂CAPCELL PAK C18MG(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)及资生堂CAPCELL PAK C18MG Ⅱ(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱分析样品，结果显示，甘草酸峰的理论塔板数及甘草酸与相邻峰的分离度均符合要求，供试品溶液与对照品溶液的典型高效液相色谱图见图1。

A. 供试品溶液；B.对照组溶液A. test solution; B. reference solution图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.5 精密度试验：取甘草酸铵对照品溶液，注入液相色谱仪，连续进样6次，按照“2.1.1”项下条件测定。结果显示，其峰面积的RSD为0.17%，色谱图见图2，表明测定方法精密度良好。

图2 甘草酸铵对照品精密度试验高效液相色谱图Fig 2 HPLC of precision of ammonium glycyrrhizinate reference substance

2.1.6 线性关系考察：分别取对照品储备液适量，用甲醇-水(V∶V=1 ∶1)溶液稀释配成浓度为353.8、70.8、35.4、14.2、7.1及3.5 μg/ml的溶液并摇匀，作为标准曲线的测试点。分别注入液相色谱仪，按照“2.1.1”项下条件测定，记录色谱图，以峰面积(Y)与对照品浓度(X)进行线性回归，计算回归方程及相关系数。结果甘草酸单铵的线性回归方程为Y=0.127 1X，r=0.999 995，结果表明，甘草酸在3.5～353.8 μg/ml的质量浓度范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.7 稳定性试验：取室温(25 ℃)放置0、1、2、4、8及14 h的供试品溶液，注入液相色谱仪，按照“2.1.1”项下条件测定，记录色谱图。结果显示，峰面积的RSD为0.63%，色谱图见图3，表明供试品溶液在14 h内稳定性良好。

图3 供试品溶液稳定性试验高效液相色谱图Fig 3 HPLC of stability test of test solution

2.1.8 加样回收试验：按照“2.1.2”项下方法配置供试品溶液，精密量取5 ml置于10 ml容量瓶中，分别加入对照品溶液(70.8 μg/ml)2.4、3.0及3.6 ml，用甲醇-水(V∶V=1 ∶1)溶解并稀释到刻度，摇匀，按照“2.1.1”项下条件测定，分析计算加样回收率，结果见表1。

表1 甘草酸的加样回收率试验结果Tab 1 Results of recovery

2.1.9 定量限的测定：按照“2.1.3”项下方法制备一定浓度的对照品溶液，当对照品溶液的浓度为1.061 μg/ml时，测得S/N为10，结果显示，定量限(S/N=10)为1.061 μg/ml。

2.1.10 重复性试验：精密称取样品(批号：20150701)3份，分别为0.10、0.15及0.20 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，每份样品在高效液相色谱上连续进样5次，按照“2.1.1”项下条件测定，记录色谱图。结果显示，3份不同浓度供试品溶液的含量RSD为0.03%，表明重复性良好。

2.1.11 样品含量测定：按照“2.1.1”项下条件测定10批样品的甘草酸含量，结果见表2。

2.2 铋的含量测定

2.2.1 测定方法：取本品约0.8 g，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加硝酸3 ml，低温加热至硝酸蒸气除尽后，在500～600 ℃炽灼使完全灰化，放冷，加硝酸溶液(1→3)10 ml分3次将残渣全部转移至滴定杯，用90 ml水冲洗坩埚并全部转移至滴定杯中，加二甲酚橙指示液3～4滴，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05 mol/L)滴定由紫红色至黄色，即得，同时做空白校正。每1 ml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05 mol/L)相当于10.45 mg的铋。

表2 10批样品的甘草酸含量测定结果Tab 2 Content of glycyrrhetinic acid in ten batches of samples

2.2.2 考察炽灼时间对测定结果的影响：精密称取本品4份，按照“2.2.1”项下方法分别炽灼1、2、4和6 h测定铋含量。试结果显示，不同炽灼时间下含量结果差异不大，炽灼时间(≤6 h)对结果无影响，见表3。

表3 不同炽灼时间下铋的含量测定结果比较Tab 3 Comparison of content of Bi with different ignition time

2.2.3 重复性试验：精密称取本品6份，按照“2.2.1”项下方法测定铋含量。结果显示，RSD为0.3%，表明重复性好。

2.2.4 回收率试验：精密称取次硝酸铋原料(铋含量为70.3%)1.804 4 g，加少量硝酸溶解后，用水定容至50 ml，制成质量浓度为25.37 mg/ml的铋离子溶液。取已知铋含量的本品(批号：20150701)6份，每份0.4 g，精密称定，分别精密加入上述铋离子溶液3 ml，按照“2.2.1”项下方法测定铋含量。结果显示，加样回收率为99.32%，见表4。

表4 铋的加样回收率试验结果Tab 4 Results of recovery of Bi

2.2.5 样品测定：按照“2.2.1”项下方法测定10批样品的铋含量，结果见表5。

表5 10批样品的铋含量测定结果Tab 5 Results of content of Bi in ten batches of samples

3 讨论

甘草酸的含量测定中，对照品溶液及供试品溶液的配置采用流动相配制时，溶液不稳定，溶液主峰的峰面积随放置时间的延长而逐渐变小，经过多重溶剂筛选，最终采用溶剂甲醇-水(V∶V=1 ∶1)配制供试品溶液及对照品溶液。

铋的含量测定中，本研究考察了硝酸溶液与水的比例，试验结果表明，当硝酸溶液与水比例为10 ml ∶90 ml时，滴定终点变色最敏锐。本研究选择了二甲酚橙为指示剂。二甲酚橙在pH>6.3时，呈现红色；pH<6.3时，呈现黄色。而二甲酚橙与金属离子形成的配合物都是红紫色，故其适用于在pH<6的酸性溶液中指示颜色。以二甲酚橙为指示剂，滴定由紫红色至黄色，滴定终点变色敏锐，易观察。原标准以儿茶酚紫为指示剂，滴定应由纯蓝色至淡黄色；在滴定检验时，发现溶液先由纯蓝色变为粉红色，之后粉红色变为淡黄色，但是变为淡黄色后，溶液有返红现象，又成为粉红色，滴定终点难以判断。EDTA可与多种金属离子络合，为了避免试验用试剂中金属离子的干扰，建议增加空白校正试验排除干扰。

综上所述，本研究的滴定方法操作简便，灵敏度高，克服了原方法终点难以判断的缺点，重复性好，测得回收率结果良好，可用于该制剂的质量控制。