唐蕊华，刘丽娜，张素风，倪永浩，李 菲

(1.陕西科技大学 轻工科学与工程学院 轻化工程国家级实验教学示范中心 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室 中国轻工业纸基功能材料重点实验室，陕西 西安 710021；2.西安交通大学 生命科学与技术学院 生物医学信息工程重点实验室 仿生工程与生物力学中心，陕西 西安 710049)

0 引言

核酸作为生命体最基本的物质之一，携带有大量信息，在动物、植物和微生物的生长、遗传和变异中起决定性作用，已被作为目标物广泛用于疾病诊断、食品安全检测和环境监测等领域[1-5].目前，常用的核酸检测技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)技术、实时定量PCR技术和等温扩增技术等[3,6,7].但这些技术需要专业技术人员在实验室使用大型的仪器才能完成，存在成本昂贵、耗时、操作复杂和不便携等缺点，难以广泛用于资源受限地区(如床旁检测)的快速检测中.因此，发展快速的核酸检测技术具有重要意义.

纸作为日常生活中随处可见的材料，具有成本低廉、便携、生物相容性好和靠毛细作用力工作而不需要额外驱动泵等优点，已被用于研发纸基核酸检测技术实现快速检测[8-11]，如艾滋病病毒(HIV)核酸检测试纸[3,9,12]、乙型肝炎病毒(HBV)核酸检测试纸[13]和沙门氏菌核酸试纸检测[14]等.但此类试纸为单一目标物的检测，而临床检测中往往同一份样本会涉及多种疾病，需要进行多次单独检测才能得到诊断结果.因此，需要开发多目标物核酸检测试纸.

目前，已有研究报道多种纸基多目标物核酸检测技术.例如，Takahashi课题组在一根试纸条上划出多条检测线得到了多目标物试纸型DNA生物传感器，可同时检测口腔中的五种病原微生物[15]，但其检测线的数量受到试纸条长度的限制.Tabeling课题组和Henry课题组分别采用喷蜡打印机将蜡打印在纸上形成疏水图形，制备得到了纸基埃博拉病毒RNA[16]和DNA多目标物检测生物传感器[17].但此类制备过程中需要石蜡打印机且操作需将多层纸折叠在一起才能完成检测，存在制备成本昂贵、操作复杂等缺陷.另外，蜡受到温度影响导致制备的疏水区域形状不稳定.因此，研究一种制备成本低廉、操作简单和检测线不受限制的多目标物核酸检测试纸具有重要意义.

本课题组在前期研究中开发了一种基于压力辅助的圆珠笔技术，可将蜡和液态金属手写在纸基材料表面，并通过加热熔化或自然风干的方式制备出疏水图案或纸基电极，成本低廉、操作简单[18].基于此研究基础，本研究拟采用压力辅助的圆珠笔芯技术将聚二甲基硅氧烷(PDMS)书写在硝酸纤维素膜和结合垫表面，室温固化后PDMS在纸上形成疏水线，制备得到核酸多目标检测试纸.对HBV和HIV核酸目标物进行检测，实验结果得知HBV/HIV核酸试纸具有高度特异性.HBV和HIV的检测限分别为0.5 nM和0.25 nM.此技术制备的多目标物核酸检测试纸具有操作简单、成本低廉的优点，可用于其它多目标物检测试纸的制备中.

1 材料与方法

1.1 材料

牛血清白蛋白 (BSA)、磷酸盐缓冲液(PBS)和十二烷基磺酸钠(SDS),购自美国MP公司；吐温 20、Tris (2-carboxyethyl)-phosphine (TCEP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和链霉亲和素,购自美国Sigma-Aldrich公司；氯金酸,购自麦克林；柠檬酸三钠、氯化钠,购自天津天力化学试剂有限公司；20×SSC缓冲液,购自美国Invitrogen公司；试纸条上的HBV和HIV对照探针、捕获探针和检测探针,由上海捷瑞生物工程有限公司合成.试纸条材料：背胶板、吸水垫、硝酸纤维素膜(Millipore HFB18002,USA)、结合垫和样品垫,均购自上海杰一生物技术有限公司.本研究中所有的其它化学试剂均为分析纯.

1.2 核酸序列的设计

本研究所用的HIV核酸序列[5]和HBV核酸序列[13]根据参考文献合成.其他核酸序列来自于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide核酸数据库，并用Primer Premier 5.0软件设计完成(详细序列见表1).

1.3 纳米金的制备

13 nm直径的胶体金颗粒是利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备而成，具体过程参照文献[9].首先，将三口圆底烧瓶和冷凝管浸泡于酸缸，使用前冲洗干净.将圆底烧瓶和冷凝管固定在铁架台上，磁力加热搅拌器置于圆底烧瓶底下，冷凝管与数控超级恒温槽相连.其次，将100 mL ddH2O加入圆底烧瓶中，磁力搅拌加热至沸腾；之后，用移液器加入4.5 mL 1% 柠檬酸钠；3 min后加入1.2 mL 0.825% 氯金酸；这个过程中液体的颜色会由淡黄色到蓝色再到紫色，最后变为酒红色.反应30 min后，将制备好的13 nm的胶体金倒入50 mL离心管中，室温保存备用.

1.4 纳米金与核酸探针的修饰

(1)检测探针的修饰：首先，分别加入20μL和25μL 500 mM的醋酸溶液(pH 4.76)，4μL和5μL 10 mM TCEP，100μL和126μL ddH2O到HIV检测探针和HBV检测探针中，使HIV和HBV检测探针的终浓度达到100μM.温反应1 h后，将124μL的HIV检测探针和156μL的HBV检测探针各自加入20 mL已制备好的13 nm的纳米金溶液中.室温反应16 h后，分别加入219.8μL 和221μL 1% SDS使其终浓度为0.01%.1 h后，分别往HIV和HBV溶液中加入1.785 mL 和1.772 mL 2 M NaCl溶液使其终浓度为160 mM.室温反应24 h后，取标记好的纳米金溶液14 000 g离心20 min，弃上清.用重悬缓冲液重悬，滴加在试纸条上，烘干进行检测.

(2)HIV对照探针和捕获探针的修饰：加入57.6μL 2 mg/ml的链霉亲和素(用PBS溶解)和10μL PBS到7.56 nM对照探针中，室温反应1 h，加入7.6μL无水乙醇使其终浓度为100μM；加入55μL 2 mg/ml的链霉亲和素(用PBS溶解)和9.7μL PBS到7.2 nM捕获探针中，室温反应1 h，加入7.3μL无水乙醇使其终浓度为100μM.

(3)HBV对照探针和捕获探针的修饰：加入32μL 2 mg/mL的链霉亲和素(用PBS溶解)和5.7μL PBS到4.2 nM对照探针中，室温反应1 h，加入4.26μL无水乙醇使其终浓度为100μM；加入27.5μL 2 mg/ml的链霉亲和素(用PBS溶解)和4.83μL PBS到3.6 nM捕获探针中，室温反应1 h，加入3.7μL无水乙醇使其终浓度为100μM.

(4)目标物的制备：用4×SSC溶液溶解目标物使其终浓度为10μM.使用时根据实验所需进行稀释.

1.5 试纸的制备

试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和背胶板组成.

(1)将样品垫(15 mm×7 mm×0.8 mm)、结合垫(10 mm×7 mm×0.2 mm)、硝酸纤维素膜(20 mm×7 mm×0.01 mm)和吸水纸(25 mm×7 mm×0.668 mm)按照此顺序两两相重叠2 mm粘贴在背胶板(60 mm×7 mm×0.2 mm)上.

(2)用程序剪切仪将其切割成7 mm宽的试纸条.

(3)用压力辅助圆珠笔将PDMS书写在硝酸纤维素膜的中间，制备疏水隔离线.

(4)用移液器将HIV和HBV的对照探针(C线)和捕获探针(T线) 滴加于硝酸纤维素膜上和将已修饰的HIV和HBV纳米金滴加于结合垫上，37 ℃烘干2 h用于检测.

1.6 试纸特异性检测

(1)单目标物核酸试纸的检测：分别用100 nM的HBV、HIV、丙型肝炎病毒(HCV)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes) 、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和阴性对照作为目标物进行检测，验证HBV核酸试纸和HIV核酸试纸的特异性.

(2)多目标物核酸检测试纸的检测：分别用50 nM的HBV和HIV混合溶液、丙型肝炎病毒(HCV)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes) 、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和阴性对照为目标物进行检测，验证多目标物核酸检测试纸的特异性.

表1 核酸探针序列

1.7 试纸灵敏性检测

(1)单目标物核酸试纸的检测：分别用100 nM、50 nM、25 nM、10 nM、5 nM、2.5 nM、1 nM、0.5 nM、0.25 nM、0.1 nM和0.05 nM不同浓度的HBV和HIV合成序列和阴性对照检测单目标物核酸试纸，确定单目标核酸试纸的检测灵敏度.

(2)多目标物核酸试纸的检测：用100 nM、50 nM、25 nM、10 nM、5 nM、2.5 nM、1 nM、0.5 nM、0.25 nM、0.1 nM、0.05 nM的HBV和HIV混合溶液和阴性对照分别检测多目标核酸试纸，确定多目标核酸试纸的检测灵敏度.

1.8 数据分析

本研究中所有实验均重复三次，检测结果的定量分析采用IPP6.0软件，所有实验结果都为Mean±SD.

2 结果与讨论

2.1 多目标物核酸检测试纸的设计

为了克服前人工作中存在的制备成本昂贵、操作复杂和不稳定等缺陷，本研究开发了一种基于PDMS的多目标物核酸检测试纸，如图1所示.

该试纸的制备过程如图1(a)所示：采用压力辅助圆珠笔将PDMS写于试纸条NC膜和结合垫中线处，在室温下凝固形成一道疏水线，目的是将不同目标物的检测区域分隔开.之后，将已修饰的HBV和HIV纳米颗粒、对照线(C)和检测线(T)分别滴加在结合垫和NC膜相应位置，37 ℃烘干备用.

检测流程如图1(b)所示：将HBV和HIV混合目标物滴加于样品垫上进行检测，通过显色情况判定结果：呈阳性或者阴性.核酸试纸的检测原理是根据碱基互补配对原则，在检测时，目标物序列的两端分别与纳米金表面的检测探针和捕获探针结合形成三明治结构在检测线处显色，纳米金表面检测探针与对照探针结合在对照线处显色.此试纸制备过程中采用的压力辅助圆珠笔均为常用的笔芯和注射器(成本约0.000 2万元)，相比于石蜡打印机(成本约2.5万元)，大大降低了制备成本；PDMS是通过划线的方式书写在结合垫和NC膜表面，只需要直尺，无需专业的制图软件和技术人员均可实现，制备过程简单；此多目标物试纸是平行检测多个目标物，检测线条数不受NC膜长度的限制，可根据实际需要制备多条检测线；PDMS凝固后不受温度变化的影响，疏水线稳定不变形.因此，本研究所制备的多目标物检测试纸具有成本低廉、操作简单和稳定的优点，可推广于其他多目标物检测应用中.

(a)试纸制备过程 (b)试纸检测过程图1 多目标物检测试纸示意图

2.2 单一目标物的检测

在实际检测中，由于HBV和HIV核酸检测经常会受到其他传染性疾病的干扰.因此，本研究使用了100 nM的HBV、HIV、HCV、副溶血性弧菌、李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的合成序列和阴性对照作为待检物分别检测了HBV和HIV单目标物试纸，分别验证HBV(结果如图2所示)和HIV核酸试纸的特异性(结果如图3所示).

从图2(a)观察到，高浓度的干扰物质用于HBV核酸试纸检测时，只有目标物为HBV的试纸检测结果呈阳性，其它目标物检测结果呈阴性；同时，通过图2(b)灰度定量结果观察，只有目标物HBV试纸灰度值明显高于其他干扰目标的灰度值，说明干扰物质对检测结果不产生影响，证明HBV核酸试纸的检测具有高度特异性.

从图3(a)观察到高浓度的干扰物质用于HIV核酸试纸检测时，只有目标物为HIV的试纸检测结果呈阳性，其它目标物检测结果均为阴性；同时，通过图3(b)的灰度定量结果观察，只有目标物HIV的试纸灰度值明显高于其他干扰目标的灰度值，说明干扰物质对检测结果不产生影响，证明HIV核酸试纸的检测具有高度特异性.

(a)HBV试纸特异性检测试纸显色结果

(b)HBV试纸特异性检测试纸灰度定量结果图2 HBV单一目标物试纸特异性检测 (1-HBV;2-HIV;3-HCV;4-副溶血弧菌;5-李斯特菌;6-大肠杆菌;7-金黄色葡萄球菌;8-沙门氏菌;9-阴性对照)

(a)HIV试纸特异性检测试纸显色结果

(b)HIV试纸特异性检测试纸灰度定量结果图3 HIV单一目标物试纸特异性检测 (1-HIV;2-HCV;3-HBV;4-副溶血弧菌;5-李斯特菌;6-大肠杆菌;7-金黄色葡萄球菌;8-沙门氏菌;9-阴性对照)

为了评价单一目标物试纸的检测灵敏度，本研究用100 nM、50 nM、25 nM、10 nM、5 nM、2.5 nM、1 nM、0.5 nM、0.25 nM、0.1 nM、0.05 nM不同浓度的HBV和HIV样本和阴性对照分别对HBV和HIV核酸试纸进行检测，其结果分别如图4和图5所示.

(a)HBV试纸灵敏性检测试纸显色结果

(b)HBV试纸灵敏性检测试纸灰度定量结果图4 HBV单一目标物试纸灵敏性检测 (1-100 nM;2-50 nM;3-25 nM;4-10 nM;5-5 nM;6-2.5 nM;7-1 nM;8-0.5 nM;9-0.25 nM;10-0.1 nM;11-0.05 nM;12-阴性对照)

从图4(a)显色结果可以观察到HBV试纸条的检测限为0.5 nM，定量分析结果如图4(b)，从图中可以观察到其灰度值随着样品浓度的降低逐渐降低；同样，从图5(a)显色结果可以观察到HIV试纸条的检测限为0.25 nM，定量分析结果如图5(b)，其灰度值随着样品浓度的降低逐渐降低.

(a)HIV试纸灵敏性检测试纸显色结果

(b)HIV试纸灵敏性检测试纸灰度定量结果图5 HIV单一目标物试纸灵敏性检测 (1-100 nM;2-50 nM;3-25 nM;4-10 nM;5-5 nM;6-2.5 nM;7-1 nM;8-0.5 nM;9-0.25 nM;10-0.1 nM;11-0.05 nM;12-阴性对照)

2.3 多目标物的检测

在验证了单一目标物试纸特异性和灵敏性的基础上，为了进一步验证本研究所制备的多目标物核酸检测试纸性能，后续工作中，本研究分别验证了多目标物试纸的特异性和灵敏性.首先，用100 nM的HBV和HIV混合样本、干扰目标物(HCV、副溶血性弧菌、李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌)和阴性对照验证了多目标物核酸检测试纸的特异性，其结果如图6所示.从图6(a)中可以观察到HBV和HIV混合样本的检测结果呈阳性，其它干扰物的检测结果均为阴性，其定量结果图6(b)的结果与显色结果相一致.

其次，用不同浓度的HBV和HIV混合目标物对多目标核酸试纸的灵敏性进行了检测，其结果如图7所示.从图7(a)的显色情况观察，在多目标核酸试纸中HBV(左)的最低检测限到0.5 nM，HIV(右)的最低检测限到0.25 nM；从图7(b)中观察到的灰度值与其显色结果相一致.从以上结果分析：多目标物试纸与单目标物试纸的检测结果(特异性和灵敏度)均一致，这说明本研究制备的多目标物核酸检测试纸检测可靠.

(a)HBV和HIV混合目标物试纸特异性检测显色结果

(b)HBV和HIV混合目标物试纸特异性检测灰度定量结果图6 多目标物试纸特异性检测 (1-HBV和HIV;2-HCV;3-副溶血弧菌;4-李斯特菌;5-大肠杆菌;6-金黄色葡萄球菌;7-沙门氏菌;8-阴性对照. 结果观察：HBV(左);HIV(右))

(a)HBV和HIV混合目标物试纸灵敏性检测显色结果

(b)HBV和HIV混合目标物试纸灵敏性检测灰度定量结果图7 多目标物试纸灵敏性检测 (1-100 nM;2-50 nM;3-25 nM;4-10 nM;5-5 nM;6-2.5 nM;7-1 nM;8-0.5 nM;9-0.25 nM;10-0.1 nM;11-0.05 nM;12-阴性对照.结果观察：HBV(左);HIV(右))

3 结论

本研究利用压力辅助的圆珠笔技术将PDMS书写在试纸的结合垫和硝酸纤维素膜上形成疏水线，从而制备了多目标物核酸检测试纸.通过实验验证此多目标物核酸试纸可以特异灵敏的同时检测HBV和HIV核酸样本.该方法成本低廉、操作简单且稳定，为多目标物检测试纸的研究提供有效的手段.