分子生物学技术在酿酒微生物研究中的应用

2018-12-07南博华润雪花啤酒中国有限公司天津分公司

新商务周刊 2018年2期

关键词：浓香型变性探针

文/南博，华润雪花啤酒（中国）有限公司天津分公司

1 与微生物群系研究相关的分子生物学技术

1.1 核酸探针杂交技术

核酸探针杂交技术是根据待检测微生物的特异性核苷酸序列合成核酸探针，在特定条件下与微生物核酸进行杂交，再用光密度测定法直接比较核酸杂交所得到的阳性条带或斑点得出定量的结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。

该方法具有快速、灵敏的特点。标记核苷酸探针可直接用来探测溶液中、固定在膜上、细胞或组织内的同源核酸序列。探针可以是长探针（100bp～1000bp），也可以是短的寡核苷酸（10～50bp）。杂交方式可以是菌落杂交、夹缝杂交或原位杂交。

1.2 PCR技术

PCR是一种体外扩增核酸序列从而得到多个核酸拷贝的技术。根据扩增的模板，引物序列来源及反应条件的不同可将PCR技术分为以下几种:1)反转录PCR技术(RT-PCR)，是在mRNA反转录之后进行的PCR扩增，可以用来分析不同生长时期的mRNA表达状态的相关性。2)竞争PCR(C-PCR)，是一种定量PCR，通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。竞争性PCR曾被用来测定受多环芳烃污染的沉降物中的编码邻基二酚-2，3-加双氧酶的dmpB基因浓度。3)扩增的rDNA限制酶切分析技术(ARDRA)，是美国最新发展起来的一项现代生物鉴定技术，它根据原核生物rDNA序列的保守性将扩增的rDNA片段进行酶切。然后通过酶切图谱来分析菌间的多样性。

1.3 SYBR GREEN荧光检测技术

在PCR反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号。而不掺入链中的SYB R染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加随PC R产物的增加而增加而检测PCR产物，而且可以定量。

1.4 电泳分离及显示技术

除我们熟知的琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭(EB)染色方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE分离)银染的方法外，还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立的分子标记。如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)，单链构象多态性(SSCP)等，都是通过实施一些变性条件改变DNA双螺旋结构(如添加线性梯度的变性剂或建立变性温度梯度等)，由于序列不同的DNA片段，其部分解链程度也不同，不同的结构对DNA 在凝胶中迁移速率影响很大，结果不同序列的DNA片段在凝胶上得以高分辨率的分离。PCR-变性梯度凝胶电泳与PCR-温度梯度凝胶电泳是根据核酸碱基序列中GC含量不同，其Tm值也不同的原理设计的。

PCR-DGGE是在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺或尿素形成从正极到负极递增的变性剂梯度。先用特定引物PCR 增幅相同长度的目的核酸片断，电泳时核酸片段的GC含量不同，变性的位置也不同，GC含量低的先变性，含量高的后变性，由于核酸变性后迁移阻力急剧增大，迁移速度十分缓慢，从而把GC含量不同的核酸分离开来。而PCR-TGGE则是从正极到负极形成一个递增温度梯度，GC含量低的先变性，含量高的后变性，从而把GC含量不同的核酸分离开来。

2 分子生物学技术在酿酒微生物群系研究中的应用

2.1 PCR技术用于酿酒微生物鉴定

伴随着生物技术进步，利用分子生物学技术鉴定技术鉴定菌种的方法已经逐渐取代了依靠形态和生理生化特征的鉴定方法。四川大学胡承教授采用18SrDNA序列分析方法，验证常规鉴定结果的准确性，得出在四川某名酒厂窖池中酵母主要以汉逊酵母、酒香酵母、固囊酵母、卵抱酵母、德克酵母和管囊酵母为主。张磊等应用18Sr DNA序列分析与常规分类方法相结合的方式，对浓香型大曲中主要酵母菌进行分类鉴定。

2.2 PCR-DGGE技术用于酿酒微生物的监测

白酒酿造过程是一个动态过程，窖池微生物、糟醅微生物与曲药微生物之间的协调作用，直接影响着酒体的最终品质，所以对白酒酿造过程中的微生物检测显得尤其重要。四川大学张文学教授利用PCR-DGGE技术对四川某名酒厂的浓香型白酒窖池发酵过程中，中层糟醅的细菌和真菌微生物群落的演变过程进行了考察。发现入窖时，细菌和真菌都有较高的多样性；随着发酵过程的延伸，细菌的多样性不断降低，发酵一周以后，则只有一种主体细菌存在；而真菌在发酵第一周发生了主体菌的更替，发酵4周以后则一直是一类GC含量差异很小的真菌占主体。

江南大学生物工程学院采用PCR-DGGE技术，动态检测、比较了浓香型和芝麻香型白酒酒醅在窖池发酵过程中细菌菌群结构的变化过程，并通过构建16SrRNA基因克隆文库，分析、鉴定酒醅中含有的微生物类群。

2.3 PCR-DGGE技术用于酿酒微生物群系多样性研究

白酒酿造环境及工艺孕育了大批宝贵而丰富的酿酒微生物资源，这些微生物通过自身的生长繁衍、交替演绎形成了其特殊而复杂的代谢网络和丰富的酶系，使之成为酿造优质白酒的无法复制的核心。因此研究白酒酿造过程中微生物的多样性及其消长规律对酿酒行业具有划时代的意义。孟镇等应用PCR-DGGE技术对浓香型白酒大曲细菌群落结构进行了系统研究；罗惠波等应用PCR-SSCP技术对浓香型白酒大曲真菌群落进行了解析；贵州大学胡萍教授利用镶嵌式PCR-DGGE免培养技术对酱香型白酒制曲过程中微生物菌落组成及其动态变化进行了研究，得出酱香型大曲间的细菌组成存在明显差异，母曲与出仓曲的相似性系数仅为0.29，随着曲药的发酵，细菌多样性下降，优势菌群变化明显。