姜 爽，崔健丽，朴喜航，郭寰宇，宋丹宁，李文杰，周东月，胡树毅，郭 焱*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.吉林大学第四医院，长春 130022）

抗生素在预防和治疗由微生物引起的感染性疾病方面发挥了重要作用，但随着耐药菌株的出现，感染性疾病的治疗愈发困难[1-2]。微生物是多种生物活性物质的重要来源，随着研究的深入，从普通环境中分离出新的微生物及生物活性物质越来越难[3]。因此，研究者们开始把目光转向一些新的特殊环境，研究表明，从药用植物根际土壤中分离得到的许多微生物均具有重要的生物活性[4-7]。紫花地丁是传统中药之一，性寒、味微苦，有凉血消肿、清热解毒之功效，主要用于毒蛇咬伤、丹毒肿痛、乳痈肠痈、痈肿疔疮等症[8]。现代药理学研究表明，紫花地丁具有较好的抗炎、抑菌、抗病毒及抗肿瘤活性[9]。因此，本研究拟从紫花地丁根部土壤中分离、筛选出具有拮抗致病菌活性的菌株，并进行菌株的分类及抗菌活性物质分析，为进一步的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 供试土样来源于药用植物紫花地丁根部土壤；供试细菌大肠埃希菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus、表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、费氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii由吉林大学第四医院检验科提供；供试培养基为改良高氏培养基、改良高氏液体培养基、营养肉汤及营养琼脂，由本实验室自制。

1.2 方法

1.2.1 根际菌的分离及纯化 称取10 g经自然风干并研细的土样，加入100 mL无菌蒸馏水中，振荡摇匀。静置后，土壤悬液进行10倍系列稀释，共3个浓度：1 g/mL，0.1 g/mL，0.01 g/mL。将上述3个浓度的土壤悬液分别加入改良高氏平板上，采用平板稀释法进行根际菌的分离[10-11]。经过多次纯化之后，挑取单菌落菌株，在改良高氏试管斜面上培养7 d 后，于4 ℃冰箱保存并进行编号。

1.2.2 活性菌株的筛选 采用四区划线接种法将上述分离得到的根际菌接种在改良高氏平板上，常规方法培养7 d后，采用琼脂块法进行抑菌活性初筛。具体方法如下：1）将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、费氏柠檬酸杆菌分别接种至营养肉汤试管中，在37 ℃条件下培养15 h；2）随后将菌液浓度用无菌生理盐水调整至1.5×106CFU/mL，均匀涂布于营养琼脂平板上，备用；3）将培养出的根际菌单菌落接种于平板上，在37℃条件下培养24 h。通过十字交叉法测量抑菌圈直径，并筛选出抑菌活性较好的菌株。

1.2.3 活性菌株的分类鉴定 将筛选得到的活性菌株菌液送至上海美吉生物医药科技有限公司进行16 s rDNA基因测序。在GenBank数据库中将所得序列进行Blast检索，以同源性较高的典型菌株为参比对象，再通过CLUSTAL X软件进行供试菌株与参比菌株之间的序列相似性比较，最后用MEGA 5.0软件构建供试菌与参比菌之间的系统进化树。

1.2.4 活性菌株发酵液抗菌活性分析 选择改良高氏液体培养基对活性菌株进行发酵，得活性菌株发酵液。采用纸片扩散法分析活性菌株发酵液的抗菌活性。挑取活化后的斜面培养基上的菌丝块接种于发酵培养基中，摇瓶（28℃，150 r/min）培养7 d后，4 000 r/min离心20 min；取上清液过0.22 μm滤膜后，滤液保存在无菌管中，备用。将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、费氏柠檬酸杆菌等5株供试靶标菌按上述初筛方法培养、调整浓度，均匀涂布于营养琼脂平板上。在无菌发酵液中放入直径6 mm的无菌滤纸，挥干后贴于含有指示菌的平板上，在37 ℃条件下培养24 h，观察并记录抑菌圈直径大小。

1.2.5 活性菌株发酵液抗菌活性物质初步分析 按上述方法制备菌株发酵液，经水饱和正丁醇萃取后，将无菌发酵液分为正丁醇层和水层。正丁醇层和水层溶液分别在37℃条件下蒸发挥干，再用无菌水溶解，过0.22 μm滤膜后得滤液，保存于无菌管中，备用。活性菌株发酵液原液、发酵液水层、发酵液正丁醇层按上述纸片扩散法进行抗菌活性测定。

2 结果

2.1 紫花地丁根际菌的分离及活性菌株筛选 根据菌种培养特征的不同从紫花地丁根部土壤中共分离出21株菌株，经过筛选，共有9株拮抗菌具有抑菌作用，其中2株菌株抑菌作用比较明显，分别命名为Y1-7、Y1-13a。菌株Y1-7抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均直径为10 mm，抑制大肠埃希菌的抑菌圈平均直径为15 mm，抑制表皮葡萄球菌的抑菌圈平均直径为14 mm，对铜绿假单胞菌、费氏柠檬酸杆菌无抑制作用。菌株Y1-13a抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均直径为9 mm，抑制大肠埃希菌的抑菌圈平均直径为3 mm，抑制表皮葡萄球菌的抑菌圈平均直径为12 mm，抑制铜绿假单胞菌的抑菌圈平均直径为 17 mm，抑制费氏柠檬酸杆菌的抑菌圈平均直径为10 mm。

2.2 活性菌株的形态鉴定 Y1-7菌落呈圆形桔红色点状分布，菌落表面光滑，气生菌丝白色，基内菌丝桔红色，边缘规则，无水溶性色素；Y1-13a菌落呈紫色片状分布，表面凸起，气生菌丝白色，基内菌丝紫色，无水溶性色素。见图1。

图1 菌株Y1-7和Y1-13a的菌落形态

2.3 活性菌株的分类鉴定 根据16 s rDNA构建的系统发育树分类结果表明，菌株Y1-7为Streptomyces sp.属；菌株Y1-13a为Streptomyces californicus属。但菌株Y1-7与Y1-13a的确切分类地位需进一步分析。见图2。

图2 基于16S rDNA核苷酸序列构建的菌株系统发育进化树分析

2.4 活性菌株发酵液抗菌活性分析 活性菌株Y1-7与Y1-13a的发酵液可以抑制金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌的增殖，抑菌圈直径为10.5～15.0 mm。另外，Y1-13a对铜绿假单胞杆菌和费氏柠檬酸杆菌具有较强抑制作用，抑菌圈直径分别为17.0 mm和10.5 mm。见图3。

图3 活性菌株发酵液抑制供试靶标菌

2.5 活性菌株发酵液抗菌活性物质初步分析 经正丁醇萃取后的菌株Y1-7发酵液，正丁醇层代谢物抑菌活性与发酵原液抑菌活性相同，水层代谢物无抑菌活性，由此可见，菌株Y1-7抑菌活性物质极性较小，排除糖类、蛋白质类等，可能为黄酮类或其他小分子极性物质。经正丁醇萃取后的菌株Y1-13a发酵液，正丁醇层代谢物无抑菌活性，水层代谢物抑菌活性与发酵原液抑菌活性相同，可知菌株Y1-3a抑菌活性物质极性较大，可能是糖类或蛋白质类等物质。

3 结语

自青霉素问世以来，人们不断从微生物次级代谢产物中提取众多抗生素[12-13]。但是，由于抗生素的长期滥用和误用导致了细菌耐药菌的出现[14]。近些年来，临床上耐药菌株种类不断增多以及细菌耐药性的出现均极大的限制了现有抗生素的临床抗感染效果，因而寻找新型抗生素已是迫在眉睫[15]。根际菌大多数分布于土壤中，是与人类健康极为密切的微生物种群，亦是产生抗生素最多的一类物种[16]。研究[17-18]表明，药用植物根部土壤中的根际菌，是一些生物活性显著、结构新颖的天然活性产物的重要来源。因此，分离和得到这些根际菌，是进行微生物资源开发，新药研制，解决临床抗生素类用药限制的重要途径，具有重大研究意义。

本研究筛选出的2株对临床常见耐药菌表现出良好抑菌效果的根际菌Y1-7和Y1-13a，具有较大的潜在应用价值。但菌株Y1-7、Y1-13a的确切分类地位、活性成分等尚不明确，有待进一步深入研究。