张红岩，项 颗，王雪冰，徐丽娜

（吉林省中医药科学院，长春 130012）

温肾通络颗粒是由熟地黄、肉桂、补骨脂、炮姜、牛膝、伸筋草、白芥子、菟丝子、枳壳9味药材经水提、干燥、加辅料制成的中药颗粒剂，具有温经通络、补肾助阳功效，可有效预防和治疗骨质疏松[1-4]。为了更好的控制质量，保证用药安全，笔者对其进行了质量标准研究，采用薄层色谱法，对制剂中各药味进行薄层色谱鉴别，结果表明牛膝、补骨脂、枳壳薄层色谱鉴别特征比较明显，重复性好，且无干扰，所以列入质量标准；此外，采取高效液相色谱法，对颗粒中枳壳所含柚皮苷和新橙皮苷进行含量测定，建立制剂中这2种成分的测定方法，并进行系列的方法学考察试验，最终测定三批样品中柚皮苷、新橙皮苷的含量，规定了含量限度[5-8]。通过以上相关研究，建立了温肾通络颗粒质量标准，为更好控制药品质量奠定了基础。

1 仪器与材料

LC-10AT型HPLC（日本岛津）；SPD-10Av型HPLC检测器（日本岛津）；LCsolution Lite色谱工作站（日本）；XS105型电子分析天平（梅特勒-托利多，十万分之一）；UV-2800型紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，250 W，频率40 KHz）。对照品柚皮苷：中国食品药品检定研究院，批号：110753-201314，96.6%，供含量测定用；对照品新橙皮苷：中国食品药品检定研究院，批号：111857-201102，99.6%，供含量测定用；吉林省中医药科学院温肾通络颗粒（批号：170601、170602、170603）；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 牛膝薄层色谱鉴别 取牛膝药材20 g，研磨到细，加甲醇试剂50 mL，通过加热回流的方法，加热1 h后滤过，得到的滤液挥干，将其残渣加蒸馏水到20 mL，通过加热的方法将其溶解，溶解后放冷，用（饱和）正丁醇提取（3次），20 mL/次，合并3次提取液，用正丁醇饱、氨试液各50 mL洗1次，取正丁醇层液，蒸干后其残渣加甲醇2 mL，作为供试品溶液。另外取对照药材4 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法，吸取样品及对照品各5 µL，点于G型硅胶板上，展开剂为三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7:3:0.5:0.05），展开后取出晾干，喷显色剂硫酸乙醇试液（10%），105℃加热，加热至斑点清晰。样品与对照品在色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图1。

图1 牛膝TLC鉴别

2.1.2 补骨脂薄层色谱鉴别 取补骨脂药材10 g，研磨到细，先加甲醇50 mL，之后超声30 min滤过，将滤液挥干后的残渣加水20 mL，加热，制冷，用水饱和正丁醇提取（3次），20 mL/次，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取补骨脂对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法，吸取上述2种溶液，各5 µL点于G型薄层板上，展开剂为正己烷-乙酸乙酯（4:1），展开取出，喷显色剂氢氧化钾甲醇溶液（10%），紫外光灯下365 nm进行检视。样品与对照品显相同颜色的斑点，见图2。

图2 补骨脂TLC鉴别

2.1.3 枳壳薄层色谱鉴别 取枳壳药材3 g，研磨至细，加入甲醇20 mL后超声处理（30 min），滤过后蒸干滤液，残渣加甲醇2 mL后作为供试品溶液。另对照品取柚皮苷、新橙皮苷，加甲醇后制成了0.5 mg/mL混合溶液，作为对照品溶液。吸取对照品和样品上述两种溶液各5 µL，点于同一硅胶G薄层板上，展开剂为三氯甲烷-甲醇-水（13:6:2）的下层溶液，展开后取出，晾干，喷显色剂三氯化铝乙醇溶液（3 %），在105 ℃加热约5 min后进行紫外光灯检视（365 nm）。样品与对照品显相同颜色的斑点，见图3。

图3 枳壳TLC鉴别

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB（4.6×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（33:67）；检测波长为282 nm。理论板数（按柚皮苷峰）不低于3 000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取一定量的对照品柚皮苷和新橙皮苷，精密称定后加甲醇，各制成80 μg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品适量研磨，精密称定细粉1 g，加入具塞锥形瓶，再精密加入甲醇（50 mL），称定重量后用超声处理（功率250 w，频率40 kHz）30 min，取出放冷后称定重量，用甲醇补足丢失的重量后滤过，取续滤液，得到供试品。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性范围考察 精密称取对照品柚皮苷、新橙皮苷，加甲醇制成各含0.295 1 mg/mL、0.311 2 mg/mL的混合溶液，精密吸取0.5 mL、1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸各个浓度对照品溶液（各10 μL），测定。横坐标为柚皮苷、新橙皮苷的含量，纵坐标为峰面积，进行绘制标准曲线。结果表明，柚皮苷在0.148～2.656 μg，新橙皮苷在0.156～2.8 μg范围内，对照品的量与峰面积积分值呈良好线性关系。回归方程：柚皮苷Y= 1933513.8X，相关系数r = 0.999 8，新橙皮苷Y = 2041786.1X，相关系数r = 0.999 7。

2.2.4.2 稳定性试验 取一批供试品溶液，在0、2、4、8、12、24、36、48 h进样10 μL，测定峰面积积分值。结果，在不同时间点测得的峰面积积分值分别如下。柚皮苷：1 266 140、1 274 072、1 291 201、1 309 236、1 269 335、1 282 508、1 278 546、1 299 005，RSD% =1.17；新橙皮苷：1 115 695、1 122 845、1 134 948、1 155 020、1 118 546、1 130 110、1 122 584、1 142 613、1 130 295，RSD% = 1.18，结果表明，2种成分在48 h内稳定。

2.2.4.3 精密度考察 精密吸取2.2.3项下供试品溶液10 μL，按照色谱条件，对同一供试品溶液连续进样6次，并测定峰面积积分值。结果，2种成分峰面积积分值分别为柚皮苷：1 229 694、1 240 047、1 249 650、1 240 109、1 233 526、1 237 798，RSD% = 1.45；新橙皮苷：1 085 590、1 091 630、1 101 921、1 094 612、1 089 216、1 092 289，RSD% = 1.42，说明仪器精密度良好。

2.2.4.4 重复性试验 对同一批次温肾通络颗粒样品按2.2.3项下方法制备供试品溶液，共6份，依法测定，6次测定结果分别为柚皮苷：3.052 0、3.084 6、3.073 0、3.091 1、2.990 6、2.996 2 mg/g，RSD% = 1.45；新橙皮苷：2.580 3、2.605 9、2.602 2、2.613 2、2.531 4、2.534 2、2.577 9 mg/g，RSD% = 1.42，测定结果表明，本方法重复性良好。

2.2.4.5 加样回收率试验 取已知含量温肾通络颗粒6份（批号：170601，柚皮苷、新橙皮苷含量30.419 9 mg/袋、25.893 1 mg/袋），分别精密加入柚皮苷、新橙皮苷对照品一定量，依法测定，计算回收率，柚皮苷平均回收率为99.62%，RSD% = 1.45；新橙皮苷平均回收率为97.61%，RSD% = 2.04，结果见表1。

表1 加样回收率测定结果

2.2.4.6 样品测定 依法测定3批温肾通络颗粒中试样品中柚皮苷、新橙皮苷含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别 牛膝主要含有黄酮、甾酮、多糖、三萜、生物碱、有机酸等成分[9]。中国药典2015版牛膝鉴别项下中用甲醇提取，蒸干加水溶解，通过上大孔树脂柱除杂制备供试品溶液，但本品为复方颗粒成分较为复杂，所以导致了甲醇提取液蒸干后水溶液颜色非常深，杂质也多，不宜选择大孔树脂柱除杂，故采用更为简单彻底的除杂方法，即水溶后用正丁醇提取，采用氨试液洗涤，可除去大部分色素等杂质，制备后的供试品溶液易于点样，不黏稠。同时，香草醛试液和10%硫酸乙醇试液的显色效果进行比较，10%硫酸乙醇试液显色效果较好，在色谱特征中干扰杂质斑点少，斑点清晰。在展开剂的选择中，通过比较三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7：3：0.5：0.05）（《中国药典》2015版（一部）牛膝鉴别项下新的展开系统）和乙酸乙酯-乙醇（4：1）[10]的展开效果研究发现，药典中的展开剂分离效果更好。

表2 3批温肾通络颗粒中柚皮苷、新橙皮苷含量测定结果mg/袋

补骨脂主要含有香豆素、黄酮、萜酚等成分[11]。在制备供试品溶液的预实验中，首先进行《中国药典》2015年（一部）版补骨脂鉴别项下通过乙酸乙酯超声提取的方法，制得的供试品溶液点样困难，黏性太大，同时，薄层色谱中荧光斑点亮度弱，提取不完全；将采用甲醇提取，提取液蒸干加水溶解后用正丁醇提取，蒸干后加甲醇溶解，所制备的供试品溶液易于点样，不黏稠。展开剂的筛选中除《中国药典》2015版一部补骨脂鉴别项下及文献[12]采用的正己烷-乙酸乙酯（4：1）外，还试验比较了环己烷-乙酸乙酯-甲苯（2：0.7：2）和石油醚-乙酸乙酯（2：3）的展开效果，结果以中国药典中补骨脂鉴别项下采用的正己烷-乙酸乙酯（4：1）展开效果最好，斑点清晰且重现性良好，无阴性干扰。

3.2 含量测定

3.2.1 专属性试验 在选定的色谱条件下，样品色谱中待测成分峰前后无杂峰干扰，基本达到基线分离，结果见图4。

图4 温肾通络颗粒高效液相色谱图

3.2.2 系统适用性试验 在色谱柱和流动相的选择中，试验比较了如下几种色谱柱和流动相的分离效果。色谱柱[13-14]：1）Agilent Zorbax SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；2）Shim pack C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；3）Waters symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；4）Apollo C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相[15-22]：1）甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）；2）甲醇-0.1%磷酸溶液（34：66）；3）乙腈-水（20：80）；4）乙腈-水（16：84）；5）乙腈-水（17：83）；6）乙腈-0.1%磷酸溶液（31：69），结果表明，除Waters symmetry C18色谱柱外，其余3种色谱柱配合甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）流动相，均能使样品中柚皮苷、新橙皮苷与其他组分达到很好分离（分离度＞1.5），其中以Agilent Zorbax SB（4.6 mm×250 mm，5 μm）和甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）组合，分离效果最好，保留时间适宜，故作为本试验的色谱条件。

3.2.3 耐用性试验 取同一批号样品，考察在测定条件有变动时对测定结果的影响程度。试验主要考察了不同色谱柱、不同柱温、不同流动相配比等变动因素对测定结果的影响。

3.2.3.1 色谱柱 本实验选用WondSil C18、Apollo C18、Agilent ZORBAX SB-C18三个不同品牌的色谱柱进行测定，结果，测得样品中柚皮苷含量分别为3.141 9、3.028 2、3.041 8；新橙皮苷含量分别为2.474 4、2.551 5、2.589 1 mg/g，2种成分含量无明显变化。

3.2.3.2 柱温 故采用ZORBAX SB-C18色谱柱，分别在20 ℃、30 ℃、35 ℃条件下测定，结果，测得样品中柚皮苷含量分别为3.031 7、2.981 4、3.002 4 mg/g，新橙皮苷分别是2.573 0、2.538 5、2.567 9 mg/g，2种成分含量无明显变化。

3.2.3.3 流动相 选择甲醇-0.1%磷酸溶液（32：68）、甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）、甲醇-0.1%磷酸溶液（34：66）3个比例流动相进行考察，结果柚皮苷含量分别为3.056 5、3.050 2、3.026 7 mg/g，新橙皮苷含量分别是2.602 1、2.590 4、2.590 0 mg/g，含量无明显变化。上述试验结果表明，在色谱条件有微小变化时，样品中柚皮苷、新橙皮苷含量无明显变化，本方法有很好的耐用性。