田 蜜，陈 芳，贺建昌

（成都军区昆明总医院药学部，昆明 650032）

黄七化瘀丸为医院制剂，由黄芪、三七、丹参等13味中药材制成，具有活血化瘀、补气利水、调补肝肾的功效，用于各型肝硬化。经临床使用多年，有显著的效果及良好的安全性。原有的质量标准仅建立了人参皂苷Rb1的含量测定方法，为了更好的控制制剂质量，保证临床用药的安全有效，现对黄七化瘀丸的原质量标准进行提升。本研究参考2015版《中国药典》及有关文献[1-10]，采用HPLC法测定其方中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl的含量，经过方法学验证，表明方法简便，灵敏度高，重复性好。

1 仪器与试药

1.1 仪器 WATERS2695-2487型高效液相色谱仪；电子天平：BP121S，日本；超声机：SY1200-T,上海声源超声波仪器设备有限公司；色谱柱：Symmetry C18 4.6×250 mm，5 μm；密理博纯水机：Z00QSV001。

1.2 试药 三七皂苷R1：中国食品药品检定研究院，110745-201318，含量94.0%；人参皂苷Rg1：中国食品药品检定研究院，110703-201529，含量95.0%；人参皂苷Rb1：中国食品药品检定研究院，110704-201424，含量93.7%；甲醇、乙醚、正丁醇、氨水、硅藻土为分析纯；乙腈为色谱纯。黄七化瘀丸（批号：14110、141007、141120）

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水为流动相梯度洗脱（见表1）；检测波长为203 nm。理论板数分别按三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1计不得少于2 500。

表1 流动相组成

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取减压至恒重的三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液；取人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，切碎，精密称取约2.5 g，加硅藻土1g研匀，置索氏提取器中，用甲醇提取至提取液无色，回收甲醇至干，残渣加乙醚30 mL，浸泡5 min，倾去乙醚液，残渣用水饱和正丁醇50 mL分次转移至分液漏斗中，加氨试液洗2次，5 mL/次，合并氨水液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，10 mL/次，合并正丁醇提取液。用正丁醇饱和的水洗涤2次，10 mL/次，合并水液，用水饱和的正丁醇10 mL振摇提取，合并前后2次的正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇定容至25 mL，用0.5 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取不含三七的阴性对照样品按供试溶液制备方法同 法制备。

2.3 方法学研究

2.3.1 线性范围考察 精密称定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl对照品适量，分别用甲醇稀释成 2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.20 mg/mL、0.10 mg/mL、0.05 mg/mL的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，测定其含量。以峰面积（A）为纵坐标（Y），三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl的浓度（mg/mL）为横坐标（X），绘制标准曲线，分别得到回归方程：Y = 467002X+7746.6，R2= 0.9997；Y= 60512X+4608.1，R2= 0.9977；Y = 409228X+6001.1，R2= 0.9995；结果显示，黄七化瘀丸的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl含量在0.05～2.0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.3.2 专属性试验 将供试品溶液与阴性对照品溶液各10 µL，按照2.1 项下色谱条件进行实验，色谱图如下图1～图5。结果表明，阴性对照样品在对照品主峰相应位置无色谱峰，样品与对照品主峰保留时间一致，说明该项检测专属性良好。

图1 三七皂苷R1对照品HPLC色谱图

图2 人参皂苷Rg1对照品HPLC色谱图

图3 人参皂苷Rb1对照品HPLC色谱图

图4 黄七化瘀丸样品（141120）HPLC色谱图

图5 阴性对照样品HPLC色谱图

2.3.3 精密度试验 取浓度为21.675 µg/mL的对照品溶液连续测定6次，结果RSD 分别为3.51%、0.39%、2.62%，均小于4%。表明该法精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批号（141120）样品6份，照样品制备方法制备测定，照上述色谱条件测定，结果RSD 分别为4.21%、7.99%、8.65%，均小于9%，表明该法重复性良好。

2.3.5 加样回收试验 精密称取同一批（141120）样品6份，分别加入一定量的对照品，按供试品溶液制备方法制备，各取10 µL进样，计算加样回收率，结果其平均回收率分别为100.8%、92.5%、98.3%，RSD%分别为6.42%、10.02%、14.82%，见表2～表4。表明该方法准确可靠。

表2 三七皂苷R1加样回收试验结果

表3 人参皂苷Rg1加样回收试验结果

表4 人参皂苷Rb1加样回收试验结果

2.3.6 稳定性研究 取供试品溶液（141107），分别在0，2，4，6，8 h进样，记录峰面积。结果峰面积平均值分别为 68 727、297 657、175 127.8 ，RSD为10.02% 、2.86%、4.30% ，表明供试品溶液在8 h内较稳定。

2.4 样品含量测定 取三批样品，每批样品平行制样2份进行含量测定，结果如表5。

表5 样品含量测定结果 mg/g

3 讨论

含量限度指标的确定：从3批样品测定结果看，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的平均值分别为0.68 mg/g、2.10 mg/g、1.76 mg/g，其80%分别为0.68 mg/g×80% = 0.55 mg/g、2.10 mg/g×80% =1.68 mg/g、1.76 mg/g×80% = 1.41 mg/g，合计为0.5+1.6+1.4 = 3.5 mg/g。即本品含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1每克不得少于3.5 mg。

原建立的含量测定方法仅测定了人参皂苷Rb1的含量，指标成分单一，参考《中国药典》2015年版一部“三七”项下，增加了三七皂苷R1；人参皂苷Rg1的含量测定，并对原测定方法进行了优化，结果提示能更好的控制黄七化瘀丸的制剂质量。

《中国药典》2015年版一部“三七”项下，含量测定也采用HPLC 法，以乙腈∶水为流动相测定，但是其检测时间长达60 min，本方法在大约20 min即可检测完成，大大节约了时间，且灵敏度高，重复性好。《中国药典》2015年版一部“三七”项下，采用甲醇溶液直接提取，本方法采用甲醇提取后用氨试液、乙醚溶液、水饱和的正丁醇溶液进行萃取分离后测定，减少了非目标成分的影响，为其他含有三七药材的成方制剂的含量测定提供了参考。