任宝琦，李成辉，金 政

（1.广东省中医院心内科，广州 510012；2.广州中医药大学，广州 510006）

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）疾病的发生发展对人类的健康产生了严重的危害，是临床心血管事件重要的病理学基础。目前有大量研究证实，血管新生和动脉粥样硬化斑块进展密切相关[1-2]。这些新生血管可促进炎症细胞聚集，并能诱发斑块出血和斑块破裂，减少斑块内新生血管亦成为治疗动脉粥样硬化斑块的一个备受关注的治疗靶点[3]。前期临床及实验证实，邓老冠心方可改善血管内皮功能及稳定动脉斑块，从而对冠心病心绞痛有治疗作用[4-6]，本研究拟进一步通过实验观察邓老冠心方对AS不稳定斑块内血管新生及导致血管新生的相关血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的影响，从而探讨其稳定AS斑块的深入作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠40只，雄性C57BL/6J小鼠10只，均为SPF级，动物来源于北京大学医学部实验动物中心，许可证编号： SCXK（京）2016-0133，动物合格证编号：033288。

1.2 饲料 基础饲料：北京科澳协力饲料有限公司生产。高脂饲料：基础饲料添加，含脂肪15%，胆固醇0.25%，北京科澳协力饲料有限公司生产。

1.3 药物及制备 辛伐他汀片，20 mg/片，杭州默沙东制药有限公司，批号 H20140046。邓老冠心方，方药组成：黄芪30 g，橘红10 g，法半夏10 g，茯苓15 g，甘草5 g，枳壳15 g，竹茹15 g，五爪龙30 g，太子参

15 g，丹参15 g，田七15 g，水蛭5 g。药材饮片由广州中医药大学第一附属医院实验中心药理研究室鉴定，并用高压灭菌蒸馏水稀释为3 g/mL中药汤剂。

1.4 试剂及仪器 2步法RT-PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司。Trizol，美国Invitrogen公司。引物由上海博尚生物技术有限公司合成。PCR自动扩增仪Eppendorf-5332型，德国Eppendorf公司。实时定量PCR仪Light Cycler2.0，瑞士罗氏公司。组织包埋机：德国LEICA公司，型号LEICA CM1900。冰冻切片机LEICA CM1900型，德国Leica公司。光学显微镜BX41型及偏振光显微镜BX-51型均日本Olympus公司。低温高速台式离心机Biofuge Stratos型，德国Heracus公司。

1.5 动物分组及给药 8周龄雄性C57BL/6J小鼠及ApoE-/-小鼠，饲养在广州中医药大学第一附属医院实验中心实验动物饲养室小鼠饲养笼内，5只/笼，饲养室恒温（22±2）℃、人工光照明暗各12 h。C57BL/6J小鼠给予普通饲料喂养，ApoE-/-小鼠给予高脂饲料饮食喂养，所有饲料均经Co60灭菌处理。小鼠20周龄时随机分为模型组、邓老冠心方大剂量组、邓老冠心方小剂量组、辛伐他汀组，10只/组。C57BL/6J小鼠作为正常对照组。给药方法：邓老冠心方高剂量组给予邓老冠心方3 500 mg/kg灌胃，1次/d；邓老冠心方低剂量组给予700 mg/kg（相当于临床用量）灌胃，1次/d；辛伐他汀组给予辛伐他汀（按成人20 mg/d折算成小鼠等效剂量）灌胃，1次/d；给药时间均为12周。模型组及正常组给予0.2 mL/只高温灭菌蒸馏水灌胃，1次/d，时间同样为12周。

1.6 观察指标及方法 小鼠处死后迅速打开胸腔，左心室逆行灌注液体至主动脉，钝性分离主动脉，主动脉根部置于4%多聚甲醛浸泡溶液中固定，CD34免疫组化半定量分析用阳性染色面积占斑块面积的百分率表示。采用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统测量并计算平均值。其余主动脉部分-80°保存。

1.7 RT-PCR检测 mRNA 表达 采用Trizol试剂抽提小鼠胸主动脉组织总RNA，微量分光光度计检测RNA样品纯度。然后按照反应体系进行逆转录以及RT-PCR反应体系及条件按试剂盒说明书进行。

以β-actin 作为内参照基因，上游：5‘-CATCCGT AAAGACCTCTATGCCAAC-3’，下游5‘-ATGGAGC CACCGATCCACA-3’，扩增片段长度171 bp；VEGF上游：5‘-CTTGTTCAGAGCGGAGAAAGC-3’，下游：5‘-ACATCTGCAAGTACGTTCGTT-3’，扩增片段长度125 bp。VEGFR2上游：5‘-TTTGGCAAATACAACC CTTCAGA-3’，下游：5‘GCTCCAGTATCATTTCCAA CCA--3’，扩增片段长度 177 bp。HIF-1α上游：5‘-GGGGAGGACGATGAACATCAA-3’，下游：5‘-GGGTGGTTTCTTGTACCCACA-3’，扩增片段长度115 bp。PCR 反应条件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，循环40次。然后进行20 min的产物溶解程序，作溶解曲线分析，将不同浓度的定量的模板的对数和相应Ct值作图。

结果判定：△Ct = Ct － Ctβ-actin。用各实验组样本的△Ct 减去正常对照组样本的△Ct，得到△△Ct，以 2－△△Ct表示 mRNA 的相对表达量。

1.8 统计学分析 所有数据应用SPSS 12.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组数据间比较采用两独立样本t检验，其他数据多组间均数比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用费希尔的LSD法；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 邓老冠心方对apoE-/-小鼠AS CD34阳性染色的新生血管含量的影响 见表1。

表1 邓老冠心方对apoE-/-小鼠AS CD34阳性染色的新生血管含量的影响（，n = 10） %

表1 邓老冠心方对apoE-/-小鼠AS CD34阳性染色的新生血管含量的影响（，n = 10） %

注：与模型组比较，## P＜0.01，△ P＜0.05 ；与小剂量组比较，▲P＜0.05

组 别 CD34阳性染色的新生血管含量模型组 7.98±2.53 DG大剂量组 3.49±0.78##▲DG小剂量组 5.46±1.12△辛伐他汀组 3.92±1.21#▲

2.2 各组小鼠胸主动脉VEGF mRNA 表达比较 见表2。

表2 各组小鼠胸主动脉VEGF mRNA 表达比较（，n = 10）

表2 各组小鼠胸主动脉VEGF mRNA 表达比较（，n = 10）

注：与正常对照组比较，### P＜0.001；与模型组比较，△△P＜0.01；与DG小剂量组比较，▲▲P＜0.01

组 别 VEGF mRNA正常对照组 1.00±0.19模型组 46.26±8.70###DG 大剂量组 19.16±2.52△△▲▲DG小剂量组 34.21±5.43△△辛伐他汀组 6.73±1.25△△

2.3 各组小鼠主动脉VEGFR-2 mRNA表达比较 见表3。

表3 各组小鼠胸主动脉VEGFR-2 mRNA表达比较（，n = 10）

表3 各组小鼠胸主动脉VEGFR-2 mRNA表达比较（，n = 10）

注：与正常对照组比较，### P＜0.001；与模型组比较，△△P＜0.01；与DG小剂量组比较，▲▲P＜0.01

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2.4 各组小鼠胸主动脉HIF-1α mRNA表达比较 见表4。

表4 各组小鼠胸主动脉HIF-1α mRNA 表达比较（，n = 10）

表4 各组小鼠胸主动脉HIF-1α mRNA 表达比较（，n = 10）

注：与正常对照组比较，### P＜0.001；与模型组比较，△△P＜0.01

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3 讨论

急性心血管事件的发生与动脉斑块的不稳定密切相关，而这种不稳定斑块又称作易损斑块，随着易损斑块研究的不断深入，斑块内血管新生和易损斑块的发生发展成为近年来研究的热点[2-3]。在缺血、缺氧、炎症、应激等病理因素的剌激下，内皮细胞激活，继之从血管壁移行入间质腔，内皮细胞增生，基底膜生成，从而成为新生血管[7]。在动脉粥样斑块区域有来自内膜与动脉腔直接相通的毛细血管和来自外膜新生的毛细血管，它们在斑块区域互相融合形成新的毛细血管丛，即成为斑块的滋养血管[8]。薄壁的滋养血管很容易破裂，造成斑块内出血，白蛋白、纤维蛋白原等血液中的成分渗漏出来，从而导致斑块的生长、肿胀，并进一步加重血管管腔狭窄[9]。因此，斑块内新生血管的形成与斑块稳定性及临床病情的变化关系密切，而斑块内新生血管的多少成为衡量斑块稳定性的一项新的指标[9-10]。研究[11]表明，微血管密度（MVD）是评价新生血管的最佳方法。CD34是一种特异性白细胞分化抗原，特异性表达于血管内皮细胞，故成为最敏感的的血管内皮细胞标志物之一，应用CD34抗体来进行免疫组化染色能更好的测定MVD[12]，是比较好的新生血管标记物。我们通过CD34免疫组化结果显示，邓老冠心方大、小剂量均可减少斑块内血管内皮细胞标志物CD34阳性表达，即减少斑块内血管新生，从而发挥其稳定斑块的作用。邓老冠心方大剂量作用更加显著。

血管新生的发生机制非常复杂，VEGF是目前所知的最关键的血管生成促进因子在生理性和病理性血管新生过程中发挥着重要作用[13]。VEGF通过其受体发挥作用，受体目前发现有3种：VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3，新生血管内皮细胞的增殖及VEGF所诱导的粘附分子表达和血管通透性的增加主要通过VEGFR-2这一重要介质实现[14-15]。缺氧是引起斑块内血管新生的基本原因[16-17]。缺氧环境中，HIF-1α是对VEGF起主要调控作用的转录因子，其可以上调下游促血管形成物质VEGF的表达[17-19]。研究[20]表明，低氧时VEGFR-2含量升高13倍。因此，HIF-1α/VEGF/VEGFR-2信号通路是AS斑块内新生血管发生的重要机制。我们的实验结果亦表明，正常小鼠血管壁表达少量的VEGF，而AS斑块内表达VEGF明显，动脉粥样硬化模型小鼠动脉壁HIF-1α表达显著增高，和文献报道一致[15,17]。

研究发现，邓老冠心方大、小剂量组均可降低AS斑块内促血管新生因子VEGF的表达，从而减少斑块内血管新生，邓老冠心方大剂量组更表现出和西药辛伐他汀组同样的优势，并呈现出剂量依赖性（大剂量组和小剂量组比较有统计学意义）。因为VEGF与受体VEGFR-2结合发挥作用，其生物学效应通过其受体实现。因此，我们同时检测受体的基因表达水平，发现邓老冠心方还有效减少了VEGFR-2结合的含量，从而影响了VEGF/VEGFR-2这一产生新生血管的作用通路。通过对HIF-1α的检测发现，邓老冠心方大、小剂量组显著减少HIF-1α的表达，通过有效降低HIF-1α水平，抑制HIF-1α/VEGF/VEGFR-2信号通路，进而抑制VEGF和VEGFR-2的表达，从而有效减少斑块内血管新生的发生。

邓老冠心方是由全国著名老中医邓铁涛教授在多年治疗冠心病的临证经验中总结出来的良方。在多年的工作中，邓老通过对冠心病病人的诊治，提出了“心脾相关”“痰瘀相关”学说，“心痛者，脉不通”，不单是血瘀为患，而痰浊闭塞，也是其主要的病理机制。该方主要功效是益气化痰，祛瘀通络，主治冠心病（气虚痰瘀互阻型），因而能显著减轻患者由气虚而致痰阻血瘀的临床症状，稳定动脉斑块均有确切的临床疗效[4-5]，能显著改善心绞痛症状，减少心绞痛发作频率及时间，并显著提高患者的生活质量。但机制研究较少，初步动物实验研究发现本方能减少动脉粥样硬化动脉斑块面积与管腔比例及稳定纤维帽，从而起到稳定动脉斑块的作用[5]，其深入作用途径仍不明确。本研究从证实邓老冠心方抑制斑块内血管新生的基础上，更加深入的从基因水平研究了邓老冠心方对斑块内血管新生的抑制作用的发生机制，发现其作用与其干预HIF-1α/VEGF/VEGFR-2信号通路，降低HIF-1α、VEGF和VEGFR-2基因表达有关，为邓老冠心方治疗疾病提供理论依据。

动脉粥样硬化发展过程中，斑块内血管新生、氧化应激、炎症反应相互影响并相互促进，本研究未进行其他通路的研究，更加全面、深入的研究其作用机制有待进一步探讨。同时受研究时间的限制，本实验仅进行了体内研究，未进行体外实验，这将是我们下一步的研究方向。