林栋 朱慧锋 张勤忠 吴世良 李良文（余杭区第二人民医院 浙江 杭州 311121）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种慢性关节病，表现为骨质增生，软骨破坏、变性等[1]。随着我国人口老龄化，OA发病率呈逐步上升。miRNA是一类短的内源性非编码RNA，通过抑制mRNA的翻译来调控机体蛋白表达[2]。miRNA参与多种炎性和自身免疫性疾病的发病过程，且可能参与OA的发展过程[3,4]。近年来，越来越多的miRNAs被证明在骨科疾病中起着重要作用[5]。而有实验证明，miRNA-214在骨质疏松的骨重塑过程中对破骨细胞的功能有调控作用[6]。为进一步研究miR-214的功能，本实验旨在探讨其在不同OA分期的表达情况，为治疗骨关节炎寻找靶向标记物提供依据。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月—2018年8月在我院因膝关节骨性关节炎住院并行人工全膝关节置换术治疗患者45例组成OA组，选择同期在我院因创伤行下肢含膝关节截肢术患者10例组成对照组，其中OA组患者术前均行双膝关节负重位X线检查，并依据Kellgren-LawrenceX线诊断标准将其分为Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组、Ⅳ级组。两组患者的一般资料见表1，入选的患者均对本研究知情同意，且获得医院伦理委员会同意。

表1 两组患者一般资料对比

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 取收集的胫骨平台软骨下骨，用陶瓷研钵将其在液氮下快速研磨成粉状，并取100 mg装入1.5ml EP管中，用TRizol 法提取RNA（每个EP管中加入1mlTRizol，振荡摇匀，室温下静置15min，然后加入0.2ml氯仿，振荡摇匀15s，再室温静置15min，4℃、12000rpm离心15min，取其上层水相0.5ml置于另一EP管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，静置15min使RNA沉淀，4℃、12000rpm离心10min后，弃上清，加入1ml75%酒精，4℃、7500rpm离心5min，再弃上清，晾干15min，加入DEPC水溶解，振荡摇匀），样本经上述裂解、分层、RNA 沉淀、洗涤和溶解后，测定 RNA 浓度和纯度，确保后续试验准确度。

1.2.2 反转录合成cDNA 根据qPCR反转录试剂盒（SYBR Green ReverTra Ace qPCR RT Kit）操作方法在37℃下配置20ul反应体系，将测定浓度后的RNA 样本加入反应体系进行反转录反应。将稀释后的5ulRNA样本和3ul的目的基因引物及内参U6加入预先按照说明书中提供的试剂配成每份7ul的混合液中，离心后放进PCR仪反应，条件设定为16℃30min、42℃ 30min 及 85℃ 5min。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测miR-214 按照说明书以及引物的Tm值制定PCR循环条件，并在Real-time PCR仪上扩增。扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性5S，55℃退火10s，72℃延长15s，进行40个循环，其结果以反应管内的荧光信号达到阈值时所需循环数Ct表示，采用2-△△Ct法进行统计，比较OA组与对照组成骨细胞内相关的基因的表达水平。

图1 两组患者成骨细胞中miR-214的表达情况（P＜0.05）

1.3 统计学分析

运用SPSS17.0统计学软件分析，各组间作比较采用ANOVA方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

通过分析miR-214在正常膝关节及OA患者成骨细胞中的表达水平（见图1），可见OA组miR-214的表达水平明显高于对照组，OA组样本中，Ⅲ级组中miR-214的表达水平明显高于其他3组，各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3.讨论

膝关节OA以关节软骨、软骨下骨进行性改变，骨质增生和滑膜组织炎症反应为主要特征，不同程度影响患者生活质量，现今OA后期治疗金标准是人工关节置换术[7]。膝关节OA复杂的发病机制尚未完全阐明，已得到越来越多学者的关注。而对骨关节炎治疗方法的探索，也成为分子生物领域的重点[8]。

近年来，有研究显示微小RNA（microRNA）在中老年退行性骨关节炎的发病中起着关键作用[9]。Iliopoulos等将OA病人和健康人分为两组，检测软骨组织中的365种miRNA表达情况，最终筛查出16种miRNA表达情况存在差异，其中9种miRNA（miR-22、483、377、16、103、30b、223、509、23b）表达上调，其余的7 种（miR-29a、337、140、25、26a、210、373）则表达下降。基于现今对于miRNAs在骨和软骨中的研究，miRNAs 被认为在调节OA中基因表达中是最具前沿、高效能的方法[10]。

有学者报道，miRNAs在骨与软骨组织的最新研究中，miR-214被发现具有调控成骨转化作用，可调控小鼠成肌细胞功能，如成骨分化功能可被抑制；同时miR-214可通过靶向调控转录激活因子，抑制成骨细胞活性，抑制其基质矿化过程，从而促进骨质疏松的发生发展[11]。然而遗憾的是未能证实miR-214在OA发展机制中的功能。

通过本实验，我们证实了miR-214在OA成骨细胞中的异常表达，并且发现，OA病人成骨细胞中miR-214明显高于正常人群，Ⅲ级组中miR-214表达最高，并且明显高于IV级，笔者认为整个OA病程可以概括为骨质吸收→骨质增生→骨质硬化→骨赘，然而都存在骨重塑。而本实验关于miR-214的表达数据可以表明miR-214可能在故重塑中起重要作用。而之所以Ⅲ级组中miR-214数据高于IV级组，可以表明骨质吸收的波动，带来miR-214的表达波动，随着增高而表达增多，但是晚期骨质增生→骨赘形成，miR-214表达又有所下降，由此判断，miR-214可能通过调控成骨与破骨细胞活性最终实现调节骨重塑过程。

综上所述，本实验认为miR-214在OA的发展中有重要作用，可能通过调控某重要基因的表达，参与关节软骨退化及骨重塑。为下一步对miR-214及其他相关miRNAs在OA中的调控机制的研究提供理论基础。