易礼智 王琴 程征宇（通讯作者）

（乐山市人民医院消化内科 四川 乐山 614000）

近年来，随着医学技术的不断进步，结直肠癌的病死率有所下降，但它仍是人类最常见的恶性肿瘤之一，且它的发病率有逐年上升的趋势[1]。DNAJA1是热休克蛋白40家族（也称DNAJ家族）成员之一，主要负责如展开错误折叠的蛋白质、折叠多肽链、参与多肽的跨膜运输、组装及拆卸蛋白质复合物并控制、调节蛋白质生成等细胞生理活动[2-3]。近年来，DNAJA1越来越多地出现在肿瘤相关领域的研究报道中。在敲除DNAJA1的小鼠C6恶性胶质瘤细胞的研究中，发现C6胶质瘤细胞敲除DNAJA1后，细胞的迁移和侵袭能力增强[4]。另外，DNAJA1可以增强神经胶质瘤细胞的放疗抵抗性[5]。但目前，DNAJA1在结直肠癌中的作用尚无文献报道。

1.材料与方法

1.1 材料

Lipofectamine2000、Trlzol购自life公司；PCR试剂盒、T4 DNA连接酶和DNA Marker均购自Promega公司；PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒和质粒小提取试剂盒均购自QIA InC公司；限制性内切酶KpnI、Xhol购自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增目的基因 DNAJA1（NM_001314039.1）的扩增编码区序列（CDS区）总共723个碱基。利用primer5软件进行引物设计。以人正常结直肠cDNA为模板对目的片段进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸90s，完成35个循环后再延伸5min。扩增完成后，分别取5ul PCR扩增产物进行琼脂糖（1.5%）凝胶电泳鉴定。

1.2.2 瞬时转染结直肠癌细胞 用含10%胎牛血清的RPMI.1640培养基培养6株结直肠癌细胞并放置在37℃、5%的C02培养箱中。转染前l天将HT29和HCT116细胞转种至6孔板，当细胞融合到60%～70%时，以脂质体（Lip0fectamineTM2000）为载体分别转染重组质粒pEGFP-C1-DNAJA1和空白质粒pEGFP-C1，48 h后收集细胞，进行Real-time PCR及Western-blot检测。

1.2.3 Real-time PCR收集细胞，按Trizol和反转录试剂说明书分别提取RNA及逆转录合成cDNA。DNAJA1上游引物 5’CCTTCAT TTGGATT CTTATCAGG3’；下游引物5’GAGCCAAAACCACCACCTGC3’；GAPDH 上游：5'-GTCCACCACCCTGTTG CTGTA-3'；下游：5'-CTTCAACAGCGACACCCACTC-3'。PCR反应体系10ul，反应条件：95℃预变性3min，95℃变性10s，60℃退火40s，72℃延伸30s，共40个循环。根据PCR反应曲线得到各样品目的基因和看家基因的Ct值，计算2-ΔΔCt值进行相对定量。

1.2.4 Western blot检测：细胞总蛋白提取及浓度测定按说明书操作。蛋白变性、制胶、电泳、转膜，封闭1h，用兔抗人DNAJA1单克隆抗体（1∶300）、鼠抗人GAPDH单克隆抗体（1∶1000），4℃过夜孵育，PBST溶液洗膜三次，每次10分钟，羊抗鼠、兔IgG二抗（1∶10000），室温孵育1h，发光显影。

1.3 统计学处理

本研究的实验数据运用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。数据结果采用均数±标准差（δ±s）表示，各项指标的两样本均数的比较采用独立样本的检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

图1 DNAJA1 在6株结直肠癌细胞中的mRNA（图A）和蛋白水平检测（图B）

图2 DNAJA1过表达载体的构建（图A）及在结直肠癌细胞HCT116和HT29中的mRNA（图B）和蛋白水平检测（图C）

2.1 结直肠癌细胞株中DNAJA1的含量

Real-time PCR 及 Western blot检测6株结直肠癌细胞：HCT-116、HT-29、LoVo、SW620、SW480、174T 中 DNAJA1 mRNA及蛋白水平。结果显示：DNAJA1在HCT116及HT29细胞中的mRNA及蛋白水平较低，在LoVo和SW620中的含量较高（见图1）。故选择HCT116和HT29细胞用于转染DNAJA1基因过表达重组质粒。

2.2 DNAJA1过表达质粒的构建及鉴定

以重组质粒为DNA模板，进行DNAJA1 PCR 扩增实验、凝胶电泳鉴定（图2A），为保证合成的DNAJA1基因编码区序列定向克隆至pEGFP-C1表达载体，进行DNA测序鉴定及BLAST比对，显示插入的碱基序列片段与目的基因完全一致，表明重组质粒构建成功。同时，我们将DNAJA1 过表达质粒转染结肠癌HT29和HCT116细胞。Real-time PCR及 Western blott 结果显示，HT29和HCT116细胞中瞬时转染DNAJA1过表达质粒后，DNAJA1 mRNA及蛋白表达水平显著增高（见图2B和2C）。以上结果显示，DNAJA1过表达质粒在结直肠癌细胞中转染及表达成功。

3.讨论

DNAJA1是HSP40蛋白家族成员之一，在与肿瘤相关的研究中，DNAJA1参与了包括蛋白降解[6]、侵袭[4]和凋亡[7]等在内的多种肿瘤细胞生理活动。在胸膜恶性间皮瘤中，DNAJA1的低表达与病人在术后短期内复发相关[8]。但它在结直肠癌中功能还没有进行深入的研究。

本篇文章中，我们首先检测了DNAJA1在6株结直肠癌细胞株中的表达情况。我们发现在高转移和侵袭的SW620和LoVo细胞中DNAJA1表达较高，而在低转移的HCT116和HT29中，表达较低。这可能表明DNAJA1 在结直肠癌的侵袭和转移中有重要作用。但这与之前报道的在恶性胶质瘤中敲除DNAJA1后促进细胞的迁移和侵袭的结论截然不同[4]。因此为了进一步研究DNAJA1在结直肠癌中的作用及分子机制，接下来，我们以人正常的结直肠cDNA为模板对DNAJA1因进行扩增。DNAJA1基因开放阅读框全长723bp，我们利用primer5软件进行引物设计，然后进行PCR扩增、酶切、胶回收、连接、转化、筛选阳性克隆以及反复验证，成功将全长DNAJA1基因克隆至过表达载体pEGFP-C1中，并借助脂质体将其瞬时转染至HCT116和HT29细胞，经Realtime和Westen-blot检测表明pEGFP-C1-DNAJA1过表达载体构建成功，并在SW480细胞株中的转染率较高，这为我们下一步进行更深入的研究创造了条件。