李爽 田威 (通讯作者) 谢花 李鹤

（沈阳药科大学 辽宁 沈阳 110016）

狂犬病是一种人兽共患急性传染病，由狂犬病毒引起的，可导致严重的中枢系统疾病，又称恐水症，是死亡率高达100%的急性传染病，被传染病防治法列为乙类传染病。狂犬病至今仍无特效的治疗方法，实施疫苗免疫是预防和控制狂犬病发病最有效的措施[1]。为保证狂犬疫苗免疫的有效性，开展对RV毒力的检测十分必要。本文旨在建立简单、快速、特异性好、敏感度高的免疫荧光的检测方法，对狂犬病毒PV-2061株进行检测。

1.材料和方法

1.1 主要材料

狂犬病毒PV-2061株：原始毒株来源于ATCC；Vero细胞：来源于中科院上海细胞库。FITC标记的抗狂犬病病毒特异性荧光抗体：购自美国Novus公司，浓度0.75mg/ml。

1.2 荧光抗体最佳工作浓度的确定

1.2.1 荧光抗体稀释：用PBS将荧光抗体2倍系列稀释，取50×、100×、200×、400×、800×、1600×共6个稀释度。

1.2.2 细胞培养：将Vero细胞稀释成1×105个/ml，加入到96孔细胞培养板中，100µl/孔，放二氧化碳培养箱中培养。

1.2.3 加毒：取一批狂犬病毒样品，稀释成浓度为1×10-3。加入到已制备好的单层96孔板中，100µl/孔，放培养箱继续培养48h。

1.2.4 固定：取出96孔板，弃培养基，PBS洗板3次，加冷丙酮，-4℃固定30分钟。弃丙酮，风干。

1.2.5 加荧光抗体：加入2倍倍比稀释的荧光抗体，每个稀释度加一列8孔，50µl/孔。37℃湿育1h，PBS洗板3次，置荧光显微镜下观察。记录荧光病灶数，以出现“++++”的抗体最大稀释浓度为其最佳工作浓度。

1.3 免疫荧光测定法

1.3.1 病毒稀释：将16批狂犬病毒样品10倍稀释，取6个稀释度（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8），接种到制备好的96孔板中，100μL/孔，每个稀释度加每列6孔，剩余2孔加培养基作为空白对照孔，培养48h。

1.3.2 按1.2.4固定。

1.3.3 荧光染色：加入最佳工作浓度的荧光抗体，50μL/孔。37℃湿育1h，洗板，镜下观察。记录荧光灶数，细胞浆内有绿色荧光颗粒者为阳性，正常细胞对照无特异性荧光为阴性，以Reed-Muench法计算病毒滴度。

1.4 小鼠测定法

将16批病毒样品10倍稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度，脑内接种小鼠，6只/稀释度，0.03ml/只。观察14d，计算结果。

1.5 重复性实验

采用两名实验人员在相同的条件下，分别用免疫荧光法和小鼠法检测同一批病毒滴度，每人检测3次，每个样品重复检测6次。

2.结果

2.1 免疫荧光抗体最佳工作浓度的确定，结果见表1

以荧光抗体清晰的显示特异性荧光，且荧光闪亮，空白对照的非特异染色弱的最大稀释比例为最佳工作浓度，本文选择100倍为最终的荧光抗体稀释倍数。

表1 荧光抗体工作浓度

2.2 病毒样品的检测结果

16批病毒液样品用免疫荧光法及小鼠脑内滴定法测定病毒滴度，结果见表2。两种方法检测的结果趋势相同，见图1。免疫荧光法与小鼠法进行比较，显示差异无统计学意义（P值为0.187，P＞0.05），相关系数为0.629，说明两种方法呈良好的正相关性。

表2 16批狂犬病毒滴度的结果

重复性实验，同一份病毒样本分别用免疫荧光法和小鼠法检测6次，结果见表3。免疫荧光法测得的结果平均值为6.81，数据与平均值的最大差值为0.19，变异系数为1.69%；小鼠法测得的结果平均值为6.95，数据与平均值最大差值为0.43，变异系数为3.31%，因此说明免疫荧光法有更好的重复性，精密度更高。

图1 16批病毒样品的滴度结果

表3 重复性实验两种方法测得的病毒滴度

3.讨论

近年来随着科技的发展，针对病毒滴度的生物学检测方法

越来越先进，但也有优势和局限性。小鼠法是《中华人民共和国药典》三部（2015版）[2]规定狂犬病毒的经典检测方法，但因其检测周期较长，动物个体差异影响实验结果等缺点，被细胞法取代是必然趋势。免疫荧光法是将荧光色素标记技术的灵敏性，再加上抗原抗体反应的特异性，两者结合的一种免疫检测技术。另外该法可精确计数被病毒感染的细胞个数，因此敏感性也很好。目前，国内也已经开始采用免疫荧光法控制狂犬病疫苗的生产过程[3]。本文采用两种方法检测狂犬病毒毒力，趋势相同，相比之下变异系数更小，且重复性和精密度更好。因此，免疫荧光法作为狂犬病毒滴度的定量测定是可行的，值得推广。