李立群，程 显，殷 楠，郑锦娟，任慧丽，南春芹，杨智全

(西北农林科技大学农学院，陕西杨凌712100)

小麦光周期反应特性及春化作用直接影响小麦品种的利用、种植区划、引种及栽培技术，间接影响产量、抗病、抗逆等许多重要的农艺性状［1］。挖掘小麦光周期基因及其春化特性，对于利用分子育种选育小麦新品种具有重大意义。

笔者所在课题组通过同源克隆得到与小麦春化作用和光周期密切相关的小麦光周期基因TaCO9－1A，该基因冬性品种较春性品种的第二外显子在321 bp处有6个碱基的缺失，关联分析表明，该等位变异与抽穗期及开花期显著关联，是一个与冬春性相关的基因［2］。

高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting curve，简称HRM)是一种基于碱基熔解温度差异所形成的不同熔解曲线的基因分析新技术。该分析技术因具有通量高、成本低、结果准确、不受检测位点限制等优点得到普遍关注［3－5］。尤其对于多样本基因分型、突变扫描、甲基化分析、序列匹配等检测优势显著［6－8］。目前，在医学疾病诊断、蔬菜、果树等作物种质资源和新品种鉴定方面应用较广［9－11］，但在小麦中的应用研究才刚刚起步。

本研究依据TaCO9－1A基因在冬春性品种中的序列差异，开发标记，利用高分辨率熔解曲线分析技术对223份小麦品种及冬春品种杂交的F2代群体进行基因分型，并采用传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行分型验证。田间表型及基因型相关分析表明，该标记及高通量分子检测方法可以快速、简单地区分小麦的冬春性。本研究对于分子标记辅助选择育种、品种冬春性检测及品种区划等具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用材料为典型的强冬性小麦品种中麦895和春性小麦品种宁春4号以及其他来自不同麦区的223份自然群体。2个分离群体，即春性品种扬麦14与冬性品种中麦895杂交后代103株F2代及其对应的F3代株系(群体Ⅰ);扬麦14和冬性品种陕农56杂交后代297株F2代及其对应的F3代株系(群体Ⅱ)。

2个杂交组合的F2代于2014年10月种植在西北农林科技大学斗口综合试验站，对标记的植株单株收获，脱粒。F3代于2015年10月种植在杨凌荣华种业有限公司试验田，2行种植，行长1 m，行距25 cm，自然群体于2014年及2015年10月种植在西北农林科技大学北校试验田，按常规田间管理。

试验所用的主要仪器包括罗氏荧光定量PCR仪LightCycler96、北京君意JY－5000电泳仪及JY－CX3B电泳槽、Bio－Rad C1000基因扩增仪等。

1.2 方法

1.2.1 小麦DNA的提取 2014年11月对自然群体叶片进行取材以提取基因组DNA;对标记的F2代群体材料叶片进行取样，并提取叶片基因组DNA，每份材料取0.2～0.3 g新鲜叶片，用液氮预冷后粉碎并放入1.5 mL离心管中，按照十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，简称CTAB)方法提取小麦基因组DNA。

1.2.2 引物设计 根据美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，简称NCBI)网站中公布的TaCO9基因序列(Gene登录号:236233)参照设计引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，纯化方式为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。试验所用的 TWS［T代表小麦(Triticum aestivum L.)，W代表冬性(winter)，S代表春性(spring)］标记扩增引物，上游引物F:5'－GGAAGAGGCGGCGGTA CGAG－3';下游引物 R:5'－GAGCGGAACCACCCGAGGTC －3'。

1.2.3 HRM分析技术反应体系及程序 PCR和HRM分析过程均在罗氏LightCycler@96上进行，反应条件见表1。HRM的反应体系为 20μL:80 ng模板 DNA，上下游引物各0.4 μmol/L，10 μL LightCycler HRM Master Mix(Roche)，1.5 mol/L Mg2+(Roche)，其余用ddH2O补足。HRM分析反应程序中首先是普通PCR反应程序，得到PCR产物后进行HRM分析。

表1 HRM分析技术反应条件

1.2.4 HRM扩增产物的序列分析 本研究采用品种中麦895和宁春4号的HRM反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，将目标片段切胶回收，用pMD18－T载体进行克隆，由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。每个品种至少测定10个克隆，以确保核苷酸序列的准确性。引物的扩增产物序列等位变异采用DNAMAN软件进行分析，并在NCBI数据库上进行比对。

1.2.5 小麦TaCO9－1A基因功能标记检测群体的多态性利用TWS引物对样品进行PCR扩增，PCR反应采用25μL体系:10×PCR 缓冲液(含 Mg2+)2.5 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2.0 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 1 μL，模板DNA 1 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.125 μL，用ddH2O 补至25μL。扩增程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃30 s，32个循环;72℃ 10 min。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，记录带型。

1.2.6 田间性状调查及其关联分析 对田间种植材料的抽穗期和开花期进行调查，记录日期。小区60%以上的穗部露出2/3记为抽穗，小区60%以上的穗中部小穗开花记为开花。其中F2∶3群体抽穗期和开花期以平均值替代。用Excel 2007对田间表型数据进行初步处理，然后使用SPSS软件对不同基因型所对应表型平均值进行t检验和Duncan's检验(由于表型数据为日期且多为4月份，因此以4月1日为参考标准，将其换算成具体时间，例如4月16日等同于16 d，5月3号等同于33 d)。

2 结果与分析

2.1 HRM技术分析中麦895和宁春4号的基因型

用特异TWS标记引物对材料中麦895和宁春4号进行HRM分析，结果显示，这2个材料的高分辨率熔解曲线差异明显(图1)，这是由于中麦895的扩增产物有6 bp碱基的缺失，而宁春4号有6 bp碱基的插入，因此产生了2种截然不同的熔解曲线，将宁春4号命名为春性小麦(TS)基因型材料，将中麦895命名为冬性小麦(TW)基因型材料。

2.2 扩增产物的序列分析

通过比对TWS引物扩增产物测序结果，发现宁春4号的扩增产物序列比中麦895的序列多6个碱基的插入(图2)。说明HRM分析的熔解曲线的差异是由TaCO9－1A基因6 bp碱基的插入/缺失引起的。

2.3 HRM技术对自然群体的基因分型

将中麦895与宁春4号作为对照，利用HRM技术分析自然群体材料的TS基因型与TW基因型，高分辨率熔解曲线与宁春4号相近的材料为TS基因型，与中麦895相近的材料为TW基因型。结果显示，在223份材料中有99份材料的熔解曲线与宁春4号的熔解曲线相近，124份材料的熔解曲线与中麦895的熔解曲线相近(具体材料未列表)，由此得出供试材料中TS基因型材料有99份，TW基因型材料有124份(图3)，表明HRM分析技术能够用于基因碱基缺失/插入等位变异的高通量分子检测。

2.4 自然群体中TaCO9－1A基因型多态性检测

利用特异TWS标记对223份供试小麦品种TaCO9－1A基因多态性进行检测，聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示，99份小麦带型与宁春4号的TS型一致，124份小麦带型与中麦895的TW型一致(图4)。该检测结果与HRM基因分型结果完全相同，说明HRM技术可以实现高通量分子检测。

2.5 F2代群体的TaCO9－1A基因型分析

利用HRM分析技术对扬麦14/中麦895、扬麦14/陕农56 2个组合的F2代群体进行检测，得到与图3相似的基因分型图。再利用传统的PAGE技术进行TaCO9－1A的遗传多态性分析，PAGE结果显示3种带型:1种199 bp的条带(TS型)、1种193 bp的条带(TW型)和既有199 bp也有193 bp的条带(TS/W型)。103株群体Ⅰ中，22株为TS型，50株为TS/W型，31株为TW型;297株群体Ⅱ中，60株为TS型，157株为TS/W型，80株为TW型(图5)，分型结果与HRM分型结果完全一致。且F2代基因型TS型 ∶TS/W型 ∶TW型=1∶2∶1的分离比例，表明利用该标记的2种方法都可以在育种的分离群体中进行基因分型。

2.6 自然群体基因型与田间表型的相关性

根据苗期、抽穗期和开花期的生长发育情况综合判断小麦品种冬春性。由表2可知，供试材料的抽穗期、开花期在2015年及2016年整体差别不大。具有TS型TaCO9－1A基因的小麦品种抽穗期或开花期较早［(14±2.14)d～(23±1.86)d］，而具有TW型TaCO9－1A基因的小麦品种抽穗期或开花期较晚［(22±2.47)d～(29±2.80)d］，且 TS型品种的平均抽穗期、开花期分别比TW型品种提早8、6 d，该标记与抽穗期及开花期显著关联(p＜0.01)。

表2 部分小麦品种在不同年份的抽穗期和开花期

2.7 F2代群体的基因型与F2∶3群体田间表型的相关性

对2个F2∶3群体的小麦材料抽穗期和开花期进行统计，用SPSS软件分别对2个群体不同基因型的表型数据进行统计分析，结果显示，2个群体中均检测到各基因型间抽穗期和开花期的差异达到了极显著水平。可见TaCO9－1A基因中6 bp碱基的插入/缺失突变会使小麦春冬性相关性状的日期显著提前。由TWS标记判定的冬春性小麦品种与田间表现及资料记载的基本一致，说明利用该分子标记检测的小麦的冬春性具有较高的准确性。

3 讨论

HRM分析是一种高度灵敏、快速扫描PCR扩增产物内单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，简称SNP)变异的简单有效的方法［12］，该技术已经成功应用于同源四倍体植物苜蓿和马铃薯的SNP基因分型和多态性检测［13－14］。笔者所在课题组前期利用HRM技术进行TaGW2－6A基因“T”插入突变的分子检测，准确区分籽粒大小基因型，并通过常规的Sanger测序验证了该方法的可靠性［15－16］。本研究利用HRM分析技术将小麦材料的冬春性明确分型。可见，HRM是一种准确而高效的SNP检测和基因分型技术，解决了小麦基因位点单碱基突变和小片段插入/缺失高通量检测的难题，为小麦分子标记辅助选择育种奠定了技术基础。

本研究同时利用HRM分析和特异的SSR标记的PAGE对223份不同小麦品种及2个杂交组合F2代群体进行了TaCO9－1A基因分型，分型结果一致，TS型材料99份，TW型材料124份。相比而言，HRM操作简单，灵敏快速、结果直观，是一种高通量的检测方法。

目前已报道的小麦春化基因主要有Vrn－A1、Vrn－B1和Vrn－D1，且对冬春性作用大小依次为Vrn－A1＞Vrn－B1＞Vrn－D1［17］，可根据这3种基因的不同显隐性组成来预测小麦品种的冬春性［18－19］。但也有其他调控因子参与影响小麦的冬春性［20］。本研究结果表明，小麦光周期基因TaCO9－1A明显影响小麦品种的抽穗期和开花期，针对该基因开发的标记可用于小麦品种的冬春性鉴定。本研究开发的高分辨率熔解曲线分析方法为高通量分子检测及标记辅助选择育种奠定了技术基础。