孔德莲，管樟萌，祖 洁，秦敬翠，马海玲，陆 燕，何 清*

（1．徐州医科大学附属市立医院，江苏 徐州 221001；2．徐州医科大学附属医院，江苏 徐州 221001）

人类的缺血性脑卒中是一种具有复杂的病理生理学机制的异质性疾病，所以想要在一个动物模型中模仿人类脑卒中的各个方面是不可行的。目前大部分卒中人群的梗死区主要在大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）供血区内，所以大部分卒中模型选择阻断MCA或者它的一个分支。传统的MCAO模型是利用线栓阻塞大脑中动脉近端制作的脑缺血模型，简称线栓MCAO。但该方法对术者技术要求高，模型制作难度较大，脑损伤体积大，动物不易长期存活，不利于对脑缺血的长期研究。大脑中动脉永久性闭塞（p-MCAO）模型采取电凝阻断小鼠一侧大脑中动脉血流方法实现同侧相应供血区皮层发生缺血性损伤，即所谓的“凝血模型”，该模型尚未像线栓法MCAO模型那样在各实验室普及。本研究通过比较p-MCAO模型与传统的MCAO模型在模型制作成功率、模型制作成功后的死亡率、脑梗死体积、神经行为学等方面的差异，探讨两种MCAO模型的优劣性和应用范围。

1 实验大鼠分组及模型制作

野生型C57BL/6J小鼠购自美国Jackson实验室，饲养并繁殖于徐州医科大学神经系统疾病研究所，饲养条件保持室温22～25℃，予以12 h光照，12 h黑暗。采用随机数表方法将48只雄性（8-12周，SPF级）野生型小鼠随机分为3组：①P-MCAO组（n=18）；②线栓组（n=18）；③对照组（n=12）。

2 远端大脑中动脉永久性闭塞模型（Permanent MCAO Model，P-MCAO）制作过程

见图1[1]。具体步骤为：（1）小鼠用小动物吸入麻醉系统，异氟烷麻醉（2）小鼠右侧卧位于手术台上，应用脱毛剂（8%硫化钠）将左侧眼部至耳部的毛发脱净，解剖显微镜下在消毒后的区域切开1 cm的切口。（3）分离皮肤并定位颞肌，掀开肌肉。（4）在透明的颅骨下找到“Y”型大脑中动脉分支的近端及远端动脉分叉。（5）用骨钻在血管分叉处打磨颅骨直至颅骨变得薄薄的一层，用精细镊小心地将动脉上方的颅骨掀开。正确分辨出MCA的分支，分别距离分叉处1 mm电凝三支动脉血管。（6）缝合伤口。

图1 P-MCAO模型示意图[2]

2.1 线栓组传统的MCAO模型制作[3,4]

手术分离颈总动脉、颈外动脉，微动脉夹暂时关闭颈总动脉，由颈外动脉注入栓子后将颈外动脉结扎，开放颈总动脉，使栓子自颈内动脉进入MCA而建立MCAO模型。

2.2 对照组

正常饲养，未予任何手术处理。

2.3 小鼠脑缺血模型制作成功标准

按照参考文献[5]评定，在造模后18 h进行神经功能缺损程度的评价：0级=无缺陷； l级=对侧前肢不能伸展；2级=对侧前肢屈曲； 3级=轻度向对侧转圈；4级=严重的转圈；5级=对侧瘫痪。

2.4 TTC染色测定脑梗死体积[6]

分别取各组术后（或者假手术后）24小时的小鼠，取脑，制作冰冻切片，将切片置于TTC染液中，用锡箔纸盖住后（避光），放入37℃保温箱中15～30 min。将数码相机固定于脑片垂直上方30 cm处拍照。正常脑组织中线粒体内的琥珀酸脱氢酶与TTC反应呈鲜红色，梗死区由于缺少线粒体而不着色。拍照后利用Image Pro Plus 6.0软件分别测出梗死侧非梗死区的面积和对侧半球的面积。两者之差即为脑梗死面积，再除以对侧半球面积，即为相对脑梗死面积比，依次得出5个相对脑梗死面积比，乘以2 mm即为相对脑梗死体积比[8]。

2.5 大鼠神经行为学检测比较

模型建立后，进行两项行为学检测比较，包括上提肢体摇摆实验（elevated body swing test，EBST）[7]和圆柱筒实验[8,9]。行为学检测采用双盲法。术前24小时对小鼠进行行为学训练，只有行为学表现符合要求的才可入组并继续后续实验。术后24 h再次进行行为学测验。

2.5.1 EBST

主要用于评价小鼠的肢体翻转功能及前肢运动对称性。术后24小时，观察者提起小鼠尾巴根部，距离地面约10 cm，记录小鼠向左右摇摆的次数，摇摆角度需＞10度，＜10度则不计入总数，20次为限。该方法主要用来观察小鼠肢体运动的对称性。计算小鼠左右摇摆的比例并加以统计。

2.5.2 圆柱筒试验

正式实验前3天内对动物进行一次行为学训练，训练时情绪过于紧张/跃出筒内者，或者10 min内贴壁次数小于5次者，不参与后续实验。分别在术前1天、术后1天用摄像机记录，每次记录10分钟，每只小鼠每个时间点记录2次，2次的时间间隔至少为30分钟。应用视频软件慢放的功能，分别计数每只小鼠每个时间点左前肢触壁（L），右前肢触壁（R）及双侧前肢同时触壁（D）次数，最终取每一小鼠同一时间点的两次计数的均值带入公式计算：行为学得分/score=（R+D/2）/（R+L=D）×100%。

2.6 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，数据以±s表示，分别进行t检验、方差分析及相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 脑卒中小鼠24 h存活率、脑梗死体积统计结果

（1）建模后24 h内，P-MCAO组死亡1只，余17只继续进行行为学观察。线栓法组死亡5只，余13只继续行为学观察。线栓组死亡率＞p-MCAO组。对照组未出现死亡。（2）TTC染后，p-MCAO组和线栓组，均清晰可见脑梗死区域（白色区域为梗死区域） ，但梗死区域在线栓组明显大于p-MCAO组（图2）。两组脑梗死体积比较较，差异有统计学意义（P＜0.05）。表1，图2。

3.2 脑卒中行为学观测统计结果

①EBST实验：p-MCAO组、线栓组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；p-MCAO组与线栓组比较，无显著差异（表2）。

图2 线栓组（A）和p-MCAO组（B）脑缺血模型TTC染色结果

②玻璃圆筒贴壁实验：p-MCAO组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；线栓组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；p-MCAO组与线栓组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 两组相对脑梗死体积结果（ ±s）

表1 两组相对脑梗死体积结果（ ±s）

注：两组相对脑梗死体积比较，差异有统计学意义（P＜0.05）

分组（group） 相对脑梗死体积（%）线栓组（n=17） 57.35±5.12 P-MCAO组（n=13） 32.87±3.79

表2 各组大鼠行为学评估（ ±s）

表2 各组大鼠行为学评估（ ±s）

注：与对照组比较，1P＜0.05；与线栓组比较，2P＜0.05

组别/行为学评分上提肢体摇摆试验评分（%）圆柱筒试验评分（%）对照组 20.11±3.32 0.27±0.10线栓组 0.00±0.001 42.23±0.021 P-MCAO组 12.11±0.021，2 15.92±2.171，2

4 讨 论

脑缺血是以脑循环血流量减少为特征的中枢神经系统疾病，具有发病率高、致残率高和死亡率高的特点，严重地影响人类的生存质量。目前我国脑血管疾病占人群死亡病因的第二位。因此，模拟人类缺血性脑血管病的发病过程，建立重复性好、观测指标易于控制的脑缺血动物模型一直是人们普遍关注的课题。因此，在过去的几十年中，本着研究脑缺血的机制以及寻找更有效的治疗药物，研究者们开发了许多脑缺血的动物模型。

脑缺血动物模型按部位分为局灶性脑缺血模型和全脑缺血模型；临床上，缺血性脑血管病多为局灶性，以大脑中动脉（middle cerebral anery，MCA）及其分支闭塞（middle cerebral artery occlusion，MACO）多见，约占脑梗死的70%。因此，制作MCA缺血并且可实现再灌注的动物模型更接近临床。MCA模型被公认为标准的局灶性脑缺血动物模型。其中，电凝法在1981年由Tamura等首先建立，并经Bederson，Osborne、Shigeno等进一步改良，2014年由Llovera[10,11]等改良后建立了电凝经颅永久性远端大脑中动脉闭塞模型（P-MCAO），本模型的优势在于造模的死亡率低，重复性好。同时梗死区主要在皮层，梗死面积的大小与大部分卒中患者的梗死体积具有一致性[11]。线栓塞法是手术分离颈总动脉、颈外动脉，微动脉夹暂时关闭颈总动脉，由颈外动脉注入栓子后将颈外动脉结扎，开放颈总动脉，使栓子自颈内动脉进入MCA而建立MCAO模型。

本实验通过TTC染色后对实验性大鼠进行梗死面积分析，获得直接测定结果数据，两种不同造模方法所造成的脑梗死体积明显不同。线栓法MCAO梗死区域主要局限于一侧半球皮质区和纹状体（图2A），p-MCAO组梗死区域主要局限于一侧皮质区（图2B），且两者之间梗死体积的比较，差异有统计学意义（P＜0.05），说明MCA损伤段不同，产生的脑梗死体积也不同。线栓法脑缺血模型主要阻塞MCA起始段，同时影响CCA，ICA的部分灌注，所以产生的梗死区域较大，影响也比较广泛。而p-MCAO法直接电凝MCA远端，对CCA，ICA等无影响，所以梗死区域局限于MCA远端供血区，对大鼠的神经功能影响也较局限。

行为学研究在神经病学神经功能研究中占有举足轻重的地位，本实验中小鼠的两种不同的缺血模型对神经功能的影响是不同的，且不同的行为学实验对神经功能的评定的侧重点也是不同的。通过EBST，圆柱筒试验两种行为学功能的检测比较，表面在脑卒中几星期p-MCAO会对小鼠造成一定的神经功能的损伤，但不及线栓法脑缺血模型对小鼠造成的神经功能缺损严重。

综上，p-MCAO由于对MCA的损伤位于远端，造成的脑梗死面积较小，脑梗死局限于大脑皮质前侧面及少量皮质下脑组织，模型制作完成后小鼠存活时间较长，适合涉及为期较长的行为学测验的实验。许多研究，像对药物的评价研究，干细胞治疗后的长期疗效研究等等，需要长期观察才能得出结论，应用此模型较为合适。而线栓法脑缺血模型对动物损伤大，模型制作完成后小鼠存活时间较短，适宜短期的脑缺血后的行为学及生理/病理/机制等的研究。