miRNAs调控动脉粥样硬化相关细胞功能研究进展

2018-10-09陈笑梅牟雅琳

厦门大学学报（自然科学版） 2018年5期

陈笑梅，牟雅琳，吕鹏，刘刚

(厦门大学公共卫生学院，分子影像暨转化医学研究中心，福建厦门 361102)

动脉粥样硬化是导致心脑血管疾病的主要原因．典型动脉粥样硬化的进程可分为4个阶段：第1阶段为启动期，即内皮激活与损伤；第2阶段为发生期，即内膜下脂质的沉积与泡沫细胞的形成；第3阶段为进展期，即血管平滑肌细胞增殖与迁移、斑块内坏死核心增大、血管新生等；最后的阶段为终止期，即不稳定性的斑块破裂引发急性冠状动脉事件[1]．上述病理过程主要涉及内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞的功能改变．

miRNAs是一类由内源基因编码的长度为21～23个核苷酸的非编码单链RNA分子，其广泛存在于各种生物体的基因组中，如病毒、植物和多细胞动物，参与转录后基因表达调控．目前，已经有大量的研究表明miRNAs在动脉粥样硬化发展过程中发挥着重要的作用，本文中将分别就miRNAs对内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞功能的影响进行综述．

1 动脉粥样硬化的分子细胞生物学基础

动脉壁是由内皮细胞构成的内膜、血管平滑肌细胞构成的中膜以及包含肥大细胞等物质的外膜所组成的三层结构(图1(a))．在正常的生理条件下，内皮细胞会阻挡外界物质，如低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)以及外周血中的单核巨噬细胞等进入到动脉壁；但是在高血压等病理条件下，内皮细胞被激活，通透性改变，外界物质就会穿过内皮细胞进入到中膜[2]．

内皮细胞的激活与损伤是动脉粥样硬化的早期事件．在病理条件下，内皮细胞被激活，通透性改变，使得外周血中的单核细胞、脂质等物质穿过内皮细胞进入到中膜，单核细胞发展为成熟巨噬细胞，并吞噬被氧化的低密度脂蛋白(oxidized LDL, ox-LDL)，发展成为泡沫细胞[3](图1(b))．这一阶段伴随着内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的表达上调、NF-κB信号通路的激活、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)的表达升高等特征[4]．

由于外周血中的单核细胞、脂质等穿过内皮细胞进入到中膜，导致中膜环境发生改变．中膜的血管平滑肌细胞开始逐渐迁移至内膜，其表型也发生改变，并促进胶原蛋白、弹性蛋白等纤维帽成分的形成[5]；同时泡沫细胞和血管平滑肌细胞在疾病发展过程中会发生死亡或部分凋亡，释放出的胞外脂质和自身的细胞碎片会逐渐积聚，慢慢形成脂质坏死核心(图1(c))．

血管平滑肌细胞的表型转化与移行在动脉粥样硬化的发展过程中扮演着非常重要的角色．

最后病变进一步发展，斑块处的巨噬细胞和血管平滑肌细胞死亡或凋亡，释放出的脂质和细胞碎片逐渐堆积形成脂质体核心，当病变严重时，薄弱的纤维帽破裂可能导致血栓的发生(图1(d))．

(a)正常动脉壁层状结构；(b)病变早期内皮细胞的激活；(c)病变发展期血管平滑肌细胞的表型转化与移行；(d)病变后期血栓的发生(参考文献[6]，经修改)．图1 动脉粥样硬化发展的阶段Fig.1 Stages in the development of atherosclerosis

2 miRNAs对内皮细胞功能的影响

2.1 miRNA-126

miRNA-126特异性高表达于内皮细胞中，研究表明其具有抑制动脉粥样硬化的作用．Harris等[7]的研究表明miRNA-126在内皮细胞上有丰富的表达，可抑制黏附分子VCAM-1的表达．趋化因子配体12(CXC-chemokine ligand 12, CXCL12)的受体CXCR4由重组人G 蛋白信号转导调控因子16(recombinant human regulator of G -protein signaling 16, RGS16)负调控，而miRNA-126可直接抑制RGS16的表达，增加CXCL12在内皮细胞的表达，减少炎性细胞招募和血液血管平滑肌细胞祖细胞含量，形成更稳定的斑块，从而抑制动脉粥样硬化的发展[8]．另有研究表明，miRNA-126的亚型miRNA-126-5p通过抑制内皮细胞增殖负调控因子(delta-like 1 homolog,Dlk1)生成进而促进内皮细胞的增殖，抑制动脉粥样硬化斑块形成[9]．

2.2 miRNA-221/222

miRNA-221/222能够促进内皮细胞的分化，但同时也抑制了内皮细胞的增殖、迁移并促进血管新生的活性，因此miRNA-221/222对于维持内皮细胞的完整性与静止状态有着重要的作用．Li等[10]发现在用高糖处理人脐静脉而造成内皮功能障碍时，可诱导miRNA-221的表达，进而使干细胞因子c-Kit表达水平下降；而抗miRNA-221寡核苷酸(AMO221)对内皮细胞处理后，miRNA-221的表达水平下降，c-Kit的表达水平则上升．Surez等[11]发现在核糖核酸酶Ⅲ核酸内切酶Dicer基因沉默后，eNOS的蛋白水平下调，而在内皮细胞中转染miRNA-221/222则可使eNOS的蛋白水平重新恢复．这些研究表明，miRNA-221/222通过调控c-Kit、eNOS来抑制动脉粥样硬化的进程．近年有研究表明，在人脐静脉内皮细胞中表达的mi-RNA-221/222 可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的E26转录因子1及其下游因子的表达，包括VCAM-1、单核细胞化学趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)和重组人血管内皮生长因子受体-1，从而阻止炎症反应的发生[12]．

2.3 miRNA-21

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是能够增殖分化为成熟内皮细胞的前体细胞，具有促进新生血管生成、修复损伤血管以及改善内皮细胞功能的作用，从而抑制动脉粥样硬化进程．Zuo等[13]发现动脉粥样硬化病变和暴露于低氧环境的EPCs中，miRNA-21的表达量上调，且EPCs的增殖能力增强，miRNA-21通过靶向结合E3泛素连接酶1(WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1, WWP1)的3′-非转录区抑制WWP1 的表达，进而激活转化生长因子-β(TGF-β)信号通路，抑制EPCs的增殖，发挥诱导动脉粥样硬化的作用．此外，Zhou等[14]通过振动剪切应力诱导 miRNA-21在人脐静脉内皮细胞中表达，发现miRNA-21能增加VCAM-1、MCP-1等黏附分子的表达水平，促进单核细胞在内皮细胞上的黏附．

2.4 miRNA-155

miRNA-155与内皮细胞功能的关系密切，但其在动脉粥样硬化中的作用尚存在争议．Wu等[15]的研究显示在肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激的内皮细胞中，miRNA-155可调控内皮细胞的炎症反应，降低NF-κB-p56和黏附分子的表达，抑制巨噬细胞黏附到内皮细胞上，发挥抗炎作用．另有研究表明miRNA-155通过靶向结合转录因子BACH1(1型血色素氧化酵素HO-1的抑制剂)的mRNA，促进HO-1的表达，保护内皮细胞而发挥抗炎作用[16]．然而miRNA-155也是炎症介质诱导免疫反应的中枢调节器，因此被认为是一种促进炎症的小分子RNA．

Sun等[17]的研究指出，miRNA-155对内皮功能具有不利作用，可直接抑制内皮细胞中eNOS的表达进而减少NO的生成，使内皮舒张功能受损．由于miRNAs的多靶点作用机制及动脉粥样硬化各阶段病理性改变的复杂性，miRNAs可表现出多种甚至相反的生物学作用．因此，miRNA-155是否通过影响内皮功能对动脉粥样硬化产生影响需要进一步的实验验证．

2.5 miRNA-92a

Liu等[18]的研究显示，miRNA-92a可能通过调控内皮细胞中Krüppel样因子2(Krüppel-like factor 2, KLF2)和KLF4的表达水平来发挥作用，KLF2和KLF4可作为miRNA-92a的靶点，通过上调miRNA-92a的表达抑制KLF2和KLF4的表达，从而促进动脉粥样硬化的发展．Loyer等[19]的研究表明miRNA-92a在ox-LDL存在时，更容易在低血流剪切力的内皮细胞中高表达，进而加剧ox-LDL对内皮细胞的损伤．另一研究显示，在高浓度尿酸的情况下，miRNA-92a的表达下调可促进KLF2的表达，进而抑制内皮细胞生长因子A的表达，最终抑制动脉粥样硬化的进程[20]．

除了以上5种miRNAs外，miRNA-10a、miRNA-712、miRNA-98、miRNA-103、miRNA-34a、miRNA-204和miRNA-146等也对内皮细胞具有一定的调控作用，从而影响动脉粥样硬化的进程(表1)．

表1 miRNAs对内皮细胞的调控

注：MKK4.丝裂原活化蛋白激酶4；SOCS5.细胞因子信号抑制蛋白5；MAP3K7/10.丝裂原活化蛋白激酶3K7/3K10；PIK3R.磷酸酯酶；E-selectin.E选择素；βTRC.β转导重复相容蛋白；TIMP3.基质金属蛋白酶抑制剂3；MMP.基质金属蛋白酶；LOX-1.植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1；SIRT1.去乙酰化酶1．↑表示促进，↓表示抑制，下同．

3 miRNAs对血管平滑肌细胞功能的影响

3.1 miRNA-143/145

miRNA-143/145是丰富表达于血管平滑肌细胞的两个高度保守的miRNAs编码的双顺反子基因簇，通过一些转录因子如血清反应因子、共激活因子、心肌素和心肌素相关转录因子等，对血管平滑肌细胞的分化起着至关重要的作用[31]．有文献报道miRNA-143/145是调控血管平滑肌细胞表型转换的关键因子，其过表达可以上调与血管平滑肌细胞表型转换相关因子的表达，如血管平滑肌α肌动蛋白(smooth muscle α-actin，SMα-actin)和肌球蛋白重链，从而促进血管平滑肌细胞向收缩型转变[32]．Cheng等[33]发现miRNA-145是正常大鼠颈动脉中表达最丰富的mi-RNA，在血管平滑肌细胞中选择性表达，并且在用血小板衍生生长因子(PDGF)所诱导的血管平滑肌细胞去分化模型以及球囊扩张损伤的大鼠颈动脉模型中，miRNA-145是血管平滑肌细胞的一种表型标志物与表型调节物．Cordes等[34]发现miRNA-143/145靶向转录因子网络包括KLF4、钙调蛋白激酶和转录因子家族成员ETS-1(E-twenty-six-1)，可促进血管平滑肌细胞分化并抑制其增殖．另有研究显示，miRNA-143/145敲除的大鼠动脉血管平滑肌细胞上SMα-actin和肌球蛋白重链的表达明显下调，导致伪足小体形成，促进血管平滑肌细胞增殖和移行[35]．miRNA-143主要调控血小板源性生长因子受体α和蛋白激酶C-ε 的表达，而miRNA-145则通过调控集束蛋白表达影响伪足小体的形成[36]．上述研究表明miRNA-143/145对血管平滑肌的表型及分化有调控作用，可以抑制动脉粥样硬化的进程．

3.2 miRNA-221/222

Liu等[37]发现在小鼠受伤的血管平滑肌细胞中miRNA-221/222的表达量上调，并出现血管平滑肌细胞的增殖，而在敲除miRNA-221/222的小鼠模型中，其血管平滑肌细胞的增殖被抑制，这种现象的出现是由于miRNA-221/222靶向结合细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p27和p57，进而调控血管平滑肌细胞的增殖与移行．另外，Davis等[38]用分子模拟技术过表达miRNA-221/222，可减少血管平滑肌细胞收缩型标记物表达，促进血管平滑肌细胞增殖和移行，而拮抗miRNA-221/222则产生相反作用．上述研究表明，miRNA-221/222在血管平滑肌细胞的增殖和移行过程中发挥着重要的作用．

3.3 miRNA-663

Li等[39]发现miRNA-663在PDGF-BB刺激的血管平滑肌细胞中表达下调，但在分化的血管平滑肌细胞中表达上调．另外，过表达miRNA-663可以上调与血管平滑肌细胞分化相关因子的表达，如SMα-actin、肌动蛋白相关蛋白SM22α、钙调节蛋白和肌球蛋白重链，并抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖和移行[39]．过表达miRNA-663可显著抑制下游因子的表达，如转录因子Jun B、肌球蛋白轻链9 (myosin light chain 9, MYL9)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)[39]．这些结果表明，miRNA-663 是通过靶向Jun B /MYL9来调控血管平滑肌细胞表型的转化．

除上述3种miRNAs外，miRNA-92a、miRNA-135b-5p、miRNA-499a-3p、miRNA-let-7g、miRNA-99a和miRNA-504 等也与血管平滑肌细胞调控有关，进而影响动脉粥样硬化的进程(表2)．

4 miRNAs对巨噬细胞功能的影响

4.1 miRNA-155

Li等[44]发现钙调控热稳定蛋白(calcium-regulated heat stable protein 1, CARHSP1)是miRNA-155的一个靶点，提高miRNA-155的表达可通过调控巨噬细胞中CARHSP1-TNF-α通路来延缓泡沫细胞的形成．Tian等[45]通过qRT-PCR技术发现miRNA-155在载脂蛋白E基因敲除(APOE-/-)小鼠的巨噬细胞中高表达，认为细胞调控因子HMG盒转录因子1(HMG-box transcription factor 1，HBP1)是mi-RNA-155 的新作用靶点，通过递送miRNA-155拮抗剂抑制miRNA-155的表达，发现巨噬细胞的脂质吞噬能力明显减弱，且APOE-/-小鼠的斑块明显消退．Wei等[46]发现miRNA-155可以直接抑制转录因子B淋巴细胞瘤蛋白6(B-cell lymphoma 6 protein，Bcl-6)的表达，进而抑制促炎因子NF-κB信号通路．Lu等[47]发现miRNA-155还可靶向结合酪氨酸激酶受体c-Fms，从而抑制单核细胞分化成巨噬细胞，减少巨噬细胞对纤维帽的降解，进而稳定动脉粥样斑块．

4.2 miRNA-125a-5p

巨噬细胞通常分为M1和M2两种类型，其中M1型巨噬细胞可促进炎症反应(即经典活化)，而M2型巨噬细胞则可抑制炎症反应(即选择性活化)[48]．巨噬细胞的极化在动脉粥样硬化过程中发挥着重要的作用[49]．Banerjee等[50]发现miRNA-125a-5p在M2型巨噬细胞中的表达量高于M1型巨噬细胞，能够抑制巨噬细胞的经典活化，促进选择性活化．Chen等[51]利用转染技术导入miRNA-125a-5p抑制剂，发现巨噬细胞对脂类的摄取能力显著提高，并上调相关清道夫受体的表达和促进炎症细胞因子的分泌，认为mi-RNA-125a-5p 可能部分参与调控ox-LDL刺激的单核细胞中的炎症反应、脂质摄取和靶蛋白氧化固醇结合蛋白相关蛋白-9(ORP9)基因的表达，而该过程有可能起到了抑制动脉粥样硬化发展的作用；通过细胞实验证实，在人急性单核细胞白血病细胞株THP-1中抑制miRNA-125a-5p表达后，各种炎症因子如IL-2、IL-6、TNF-α及TGF-β表达水平增加，同时巨噬细胞的清道夫受体表达也上调，脂质摄入增加．以上研究表明miRNA-125a-5p发挥着抑制动脉粥样硬化的作用．

表2 miRNAs对血管平滑肌细胞的调控

注：JNK.c-Jun氨基末端激酶；MEF2C.肌细胞增强因子-2C；AGT.血管紧张素原；AT2R.血管紧张素Ⅱ受体；ACE-1/2.血管紧张素转化酶抑制剂1/2；E1k-1.核转录因子E-26样蛋白；mTOR.哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；IGF-1R.胰岛素样生长因子1受体；Grb10.生长因子结合蛋白10；Erg2.Eag相关蛋白2．

4.3 miRNA-147

Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是天然免疫系统中特异的Ⅰ型跨膜受体及病原模式识别受体，在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中起重要作用[52]．Liu等[53]在脂多糖喂养的小鼠巨噬细胞中，观察到多种TLR均可刺激产生miRNA-147，而mi-RNA-147 可负调控TLR相关的信号，证明TLR刺激可诱导miRNA-147的表达，从而阻止过度的炎症反应这一负反馈环路．

4.4 miRNA-33

增加三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)的表达对高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)的产生及逆向胆固醇转运至关重要[54]．研究发现，用miRNA-33抑制剂对小鼠进行处理，ABCA1表达增加，HDL水平上升，细胞胆固醇外排功能增强[55]．在非洲绿猴体内注射miRNA-33抑制剂，12周后也发现血浆中HDL持续上升，动脉粥样硬化进程减缓[56]．过表达mi-RNA-33 可引起ABCA1 mRNA、蛋白质及血浆HDL水平下降[57]，而抑制内源性miRNA-33表达会增加ABC-A1 蛋白的表达[58]．Ouimet等[55]认为miRNA-33可靶向巨噬细胞中关键的调控子和效应因子，减少脂滴的分解代谢．

此外，其他相关研究揭示miRNA-342-5p、miRNA-21、miRNA-223、miRNA-9和miRNA-181a等均对巨噬细胞功能具有调控作用，进而影响动脉粥样硬化病变发展(表3)．

5 展望

近年来，对miRNAs与动脉粥样硬化之间关系的研究逐渐增多，成为一个新兴且热门的领域．以mi-RNAs 为基础来治疗干预动脉粥样硬化前景广阔，但仍有很多问题急需解决，如：同一miRNA同时具有多个作用靶点，可同时作用于多种细胞，以及代谢稳定性等．通过深入揭示miRNAs与靶基因之间的调控机制，进一步发展miRNAs相关递送技术如纳米基因载体系统，可有助于达到预防和干预动脉粥样硬化的目的．