纪佼佼，严 慧，沈 敏

（1.华东政法大学，上海200042；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海200063）

鉴定结果的可靠性、科学性是法医毒物鉴定中最为重要的要求，而生物检材的选择对于鉴定结果有着重要的影响。目前法医毒物鉴定实践中，通常采用血液和尿液检材来证明近期毒物的摄入情况，判断是否摄毒、中毒以及确定死因。在死后毒物学领域，当毒物半衰期短，以及血液检材不可获得或可靠性存疑时，探寻毒物和代谢物浓度高、定性认定能力强的生物检材或血液的替代检材显得尤为重要。

胆汁排泄是毒物及其代谢物的重要消除途径之一，较传统生物检材胆汁，具有毒物和代谢物浓度高、检测时限长等特性，这在死后毒物学领域具有优势和潜力。目前国外仍将胆汁作为常规生物检材采集并检测[1]，并有大量的应用研究报道，而在国内的鉴定实践中胆汁并未受到应有的关注和重视。本文回顾了近20余年的文献报道，综述了胆汁构成和毒物的转运消除，胆汁中毒物分析的研究成果，提供了300余例案件中100多个毒药物的胆汁和血液定量结果数据，探讨了胆汁毒物定性、定量分析的特点、价值及其问题，并对其应用前景进行了展望。

1 胆汁概述

1.1 胆汁的构成

胆汁是人体中一种不含有消化酶的消化液，储存于胆囊之中。人体中75%的胆汁由肝细胞分泌产生，25%由胆管细胞产生，成人每日的分泌量大约在600～1 000 mL，胆汁中约95%的成分为水，同时还含有胆汁酸和胆红素，胆汁的颜色由胆红素的含量所决定。此外，胆汁中含有卵磷脂、胆固醇、钠、钾、钙、磷酸盐和碳酸盐等，以及少量蛋白质等成分，其pH约为7.4。胆汁的分泌是一个连续的不间断的过程，其分泌量会随着人体的运动、饮食情况而发生变化，在不进行消化时，人体所分泌的胆汁储存在胆囊之中并进行浓缩，而当人体需要进行消化时，在受到刺激的情况下储存在胆囊中的胆汁进入十二指肠帮助消化作用。

1.2 肝肠循环

毒药物在体内的排泄主要是通过肾脏、胆汁、乳腺等渠道进行。毒药物经肝脏转化，以代谢物或原药的形式进入胆汁，后经过胆汁总管进入十二指肠，其中一部分被小肠吸收，由门静脉流回肝脏，然后再经胆汁进入肠道，如此往复，形成肝肠循环。肝肠循环存在两种方式：一种是通过胃肠道的重吸收，另一种是结合型代谢物经肠道中细菌和酶（如β-葡萄糖醛酸酶）水解释放出毒药物原体进而在小肠内重新吸收。肝肠循环可使毒药物反复循环于肝脏、胆汁、肠道之间，延长毒药物的半衰期，从而延缓排泄而使血药浓度维持时间延长。肝肠循环提高了药物的利用效率，但对于毒性物质而言则增强了对人体的损害，如吗啡、秋水仙碱、劳拉西泮或地高辛等物质都受肝肠循环作用的影响，在药动学上表现为药时曲线出现多峰现象，半衰期延长，从而延长毒药物对机体的作用时间[2]。

1.3 胆汁排泄及其影响因素

胆汁排泄是外源性毒药物的重要消除途径之一。虽然胆汁排泄是毒药物原体的次要排泄途径，但却是多数代谢物尤其是水溶性代谢物的主要排泄途径。在肝细胞内的毒药物渗透可以通过被动扩散或通过转运体的主动转运，一般而言，化合物的分子量或亲水性越高，其扩散就越依赖于主动转运。外源性物质的胆汁排泄需要穿过两个细胞膜:在血窦侧的肝细胞的基底外侧膜，以及形成胆汁管的顶膜。

毒药物及其代谢物经胆汁排泄往往是主动过程，胆汁排泄的影响因素一直是多年来研究的热点。早在20世纪70年代就有研究报道胆汁排泄分子量的阈值：大鼠约为 325 g/mol，人类约为500～600 g/mol[3-4]。该研究认为分子量低于上述数值的化合物不太可能在胆汁中被排出，但笔者认为随着分析方法及分析水平的不断进步该阈值会有所降低。最近的研究表明，分子量不足以预测胆汁中药物的浓度，因此以位阻效应、渗透性、溶解度、极化性等理化性质为基础的更为复杂的定量结构-药代动力学参数关系或基于生理的药代动力学模型得以建立[1]。还有报道提出胆汁排泄的另一个决定性因素是位于肝细胞窦和小管膜上的转运体的亲和力[5-6]，而这些研究主要聚焦于内源性的物质，涉及药物间的相互作用或某些治疗类的抑制剂，如抗癌、抗生素和抗病毒药物，而在法医毒理方面关注较少。

肾和肝胆是人体重要的排泄器官，两者的排泄能力存在相互代偿现象，这对于肾功能或肝功能不全者的毒物分析结果解释具有一定的指导意义。

2 胆汁毒物分析研究现状及进展

定性筛选分析是法医毒物分析中最重要、最基本的环节，1972年Hoffman等[7]首次报道了利用冻干法关联薄层色谱对胆汁中常见未知毒药物进行筛选。之后高效液相色谱/二极管阵列检测器（HPLC-DAD）、气相色谱/质谱（GC-MS）、液相色谱/质谱（LC-MS）等筛选分析方法不断应用，对胆汁中毒药物的研究和应用逐渐增多。

表1总结了300多个案例中血液和胆汁中毒物浓度，以供比较分析和结果解释。值得关注的是，约80%的毒药物胆汁/血液浓度比大于1。Vanbinst等[121]报道了胆汁及血液中36种滥用药物的筛查情况，结果显示胆汁中检出可卡因、2-乙基-1，5-二甲基-3，3-苯基吡咯烷（EDDP）、 MDMA、美沙酮、吗啡和可待因等物质而血液中上述物质的检出率仅为63.7%（n=44），提示了胆汁可以应用于毒药物的大规模筛查。

然而，有部分研究中也出现血液检出毒药物而胆汁未检出的情形。如Vanbinst等[121]对44个案例进行血液和胆汁的比较研究，结果有6例（13.6%）胆汁中未检出氯巴占、可卡因、可待因、3，4-甲氧基苯丙胺（MDA）等成分，而血液中检出。作者认为可能是死者摄毒后快速死亡，或血液检材分析方法灵敏度优于胆汁。

同时，研究表明不同的毒物在胆汁中的存在情况及其与血液浓度之间的关系上有所不同。

表1 涉毒死者血液和胆汁中毒药物浓度

续表1

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2.1 乙醇

血液中乙醇含量鉴定是最为常见的法医毒物鉴定项目。由于尸体腐败、死后再分布、死后生成、血液缺失等因素可致无法准确获得血液乙醇浓度，故在20世纪末胆汁作为可替代检材成为人们研究的热点。Winek、Budd等人研究结果显示胆汁乙醇浓度与血液乙醇浓度存在良好的相关性，相关系数分别为 r=0.927，n=37[122]；r=0.9107，n=189[24]；r=0.94，n=100[123]。尽管如此因受摄入到死亡时间间隔、乙醇浓度等因素的影响，不能简单使用胆汁乙醇浓度来推算血液乙醇浓度。Gilliland等[124]对55例腐败尸体研究结果显示：在胆汁和血液中检出乙醇，而在尿液及玻璃体液中仅检出低浓度乙醇或未检出。对此作者认为胆汁类似其他生物基质，细菌污染可能导致死后生成乙醇，筛查乙醇代谢物乙醛葡萄糖醛酸苷有助于鉴别乙醇来源。乙基葡萄糖醛酸苷主要通过胆汁排泄，胆汁浓度远高于血液是其优势。另外，也有报道将胆汁中乙醇浓度与其他基质的分析结果进行关联性分析用于研究死亡环境以及评估乙醇是否系死后生成。

2.2 阿片类

吗啡在体内与葡萄糖醛酸结合形成代谢物吗啡-3-葡糖苷酸（M3G）和吗啡-6-葡糖苷酸（M6G），吗啡及其结合型代谢物主要通过胆汁排泄并存在肝肠循环，故以较高浓度分布于胆汁并有较长的检出时限。Crump等[125]对胆汁及血液中吗啡及可待因的浓度进行对比分析，结果显示两种物质在血液及胆汁中存在良好的相关性（r≥0.99）。 Tassoni等[126]报道了一起海洛因中毒案例，在末次注射海洛因后144h，胆汁中仍可检出（21.3μg/mL吗啡）而血液中呈阴性，为摄入海洛因后较长时间内的鉴定提供了方法及依据。丁丙诺啡及其代谢物去甲丁丙诺啡表现为大量通过胆汁排泄，平均胆汁/血液浓度比达9638（n＝12）。

2.3 大麻类

Fabritius等[25]报道四氢大麻酚（THC）的胆汁/血液浓度比较低，但其代谢物11-羟基-四氢大麻酚（11-OH-THC）、11-去甲-9-羧基-四氢大麻酚（THCCOOH）、THC和 THCCOOH葡萄糖醛酸苷等则有较高的胆汁/血液浓度比。Lin等[127]报道了在50例涉大麻死亡的交通事故案例中，总THCCOOH（包括游离THCCOOH及THCCOOH葡萄糖醛酸苷）胆汁/血液浓度比范围为17.2～888，同时作者提出胆囊中存在的THCCOOH葡萄糖醛酸苷易被肠道菌群水解并且被重吸收，这也提示肝肠循环对于延长大麻类物质的检测时限具有一定的效能。Gronewold等[128]对大麻类物质在人体的分布情况进行了研究，结果显示THCCOOH葡萄糖醛酸苷和THCCOOH在胆汁中存在较高的浓度，峰值浓度分别为11 160和990 ng/mL，且胆汁与血液中THCCOOH葡萄糖醛酸苷呈现出良好的相关性（r＞0.99）。 在胆汁中同时检出了四氢大麻酚（THC）、大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）和 11-羟基-四氢大麻酚（11-OH-THC）等物质，而在心血、股静脉血及尿液中则无法检出较低浓度的大麻类物质。Fabritius等[25]证实了上述结果，并且提出CBD/THC比值较高可以作为药用大麻摄入的反映，同时得出胆汁与血液中上述物质存在良好的相关性且相关系数均大于0.997，由此作者认为胆汁可以作为一种良好的生物检材用于较低浓度的大麻类代谢物的分析及其在人体分布情况的考察。

2.4 可卡因

Fernández等[129]应用放射免疫法测定了 20例可卡因中毒案件，其中胆汁/血液浓度比为 2.15～107.53（＝30.79）。 Agarwal等[130]报道了 50 例案件中可卡因及其代谢物胆汁/血液浓度比值为5～7。两项研究在数值上存在的差异可能与放射免疫法不能有效区分可卡因及其代谢物有关。Fernández等[131]还通过了对30例案件中胆汁可卡因及其代谢物苯甲酰爱康宁进行分析，结果显示可卡因阳性90%、苯甲酰爱康宁阳性100%，胆汁中苯甲酰爱康宁浓度高于可卡因的占83%。同时胆汁中可卡因浓度显著高于血液，浓度比为 2.2～470.6（＝64.8）。 作者还报道了20例可卡因中毒死者的血液及胆汁结果，胆汁中可卡因浓度高于血液，浓度比范围为2.15～107.53（＝30.76），但呈弱相关性（r＝0.48）。 对此，作者认为胆汁仅可作为血液的替代检材，证明是否摄入过可卡因，而不能准确地用于推算血药浓度。

2.5 苯二氮卓类

Hasegawa等[132]报道了一例服用过量氟硝西泮而致死的案例，对其13种体液和组织中氟硝西泮及其代谢物7-氨基氟硝西泮的浓度进行分析。结果显示除脂肪组织外，其余人体体液和组织中7-氨基氟硝西泮的浓度均高于原体氟硝西泮且在胆汁中尤为显著，同时胆汁与血液氟硝西泮、7-氨基氟硝西泮呈现良好的相关性，相关系数分别为0.9996和0.9995。其他研究也给出了胆汁与血液良好相关性的发现，如地西泮（r＝0.9983）、去甲地西泮（r＝1）、溴西泮（r＝0.9896）。 由此可见，胆汁可以作为有价值的检材应用于涉苯二氮卓类及其代谢物中毒等案件。Robertson等[133]比较了19例涉苯二氮卓类药物（硝基苯二氮平、氟硝西泮、氯硝西泮）死者血液和胆汁中母体药物及其7-氨基代谢物的浓度，结果显示母体药物的相关系数为0.695，代谢物相关系数为0.829。作者还对其他可供选择的检材（玻璃体液、肝脏、尿液）进行了比较分析并认为：通过不同种类的生物检材分析，可相互补充，客观地评价苯二氮卓类药物的中毒案件。

2.6 其他物质

Fanton[134]报道了128例甲丙氨酯使用过量死亡的案例，分析结果表明胆汁中甲丙氨酯的浓度较血液低，但两者间具有显著的相关性（r＝0.994），据此作者认为胆汁可以作为检测甲丙氨酯的替代检材。同时研究也表明，当血液浓度较高时（≥100 mg/L），胆汁浓度结果较为分散，但两种检材之间仍存在一定的相关性（r＝0.66），故作者认为胆汁和血液中甲丙氨酯浓度的相关性与个体的药代动力学的消除模式有关，同时也受毒物的相互作用、甲丙氨酯摄取到死亡的时间间隔等因素的影响，故血液甲丙氨酯浓度不能从胆汁推算。Bevalot等[135]也提出了同样的观点，其研究认为对于甲丙氨酯胆汁/血液浓度比较低（接近于1），虽然两种检材之间存在着显著的相关性，但也存在着不可忽略的分散度，因此作者建议使用统计学的方法由胆汁推算血液中的浓度，从而估计不确定性。

Tennakoon[136]报道了8例卡巴呋喃中毒案件，胆汁中检出率为20%。Hopenwasser等[58]报道的喹硫平中毒案件，胆汁中检出率为62.5%（n=8）。Tominaga等[137]考察了2009—2014年中毒死亡案件，对尸体胆汁及血液中毒物浓度的相关性进行分析，结果显示，扑尔敏、双氢可待因、苯海拉明、氯丙嗪等存在相关性，而唑吡坦、帕罗西汀、咖啡因等则显示出弱相关性及分散性结果。但上述具有相关性的物质能否从胆汁浓度推算血液浓度还需进行大量的研究来证明。

Bevalot等[135]将动物实验与系列案例结合起来，以6种目标物（甲丙氨酯，吗啡，氰美马嗪，咖啡因，地西泮和西酞普兰）评估胆汁作为血液的替代检材定性和定量分析的可行性。胆汁定性分析可检出血液中检出的所有目标物，动物实验显示胆汁较血液有更宽的时间检测窗口。定量结果解释较为有限，具有高胆汁/血液浓度比值的吗啡、西酞普兰、氰美马嗪的两者相关性较差。地西泮动物实验血液与胆汁浓度的相关性良好（r=0.961，n=20），但案例数据相关性较差 （r=0.447， n=23）。

3 胆汁毒物分析结果评价

3.1 胆汁与血液毒物分析的相关性

法医毒物鉴定的主要目的在于评估毒物的摄入量及其与死亡之间的关系，根据生物检材中毒物的定性及定量结果可以对此提供信息并做出解释，而这通常是基于血液浓度来进行的。然而当毒物暴露水平较低或中毒延缓死亡、毒物半衰期较短时，以及血液检材不可获得或可靠性存疑时，胆汁可以作为一种较为理想的替代检材。有学者认为胆汁由于其自身的成分（胆汁盐等）及碱性，不易滋生细菌，不易造成检材的污染[2]。大量案例报告及研究表明，胆汁中毒物浓度通常高于血液且浓度比可能达到较高数值。胆汁较血液的优势尤其表现在检测时限方面，采用同样的分析方法胆汁较血液通常具有更宽的检测窗口，对于定性筛查具有明显优势。虽然关于胆汁中毒药物浓度的定量解释的研究较少，但部分研究显示胆汁和血液浓度之间存在着显著的相关性，因此，胆汁可以为血液中毒物浓度分析提供补充与验证。

毒药物在血液和胆汁中的不同存在情况及浓度差异表明胆汁具有较长的检测窗口，对于毒物暴露水平较低、摄毒延缓死亡和毒物半衰期较短的情形尤其具有优势，如海洛因（6-单乙酰吗啡）（半衰期 6～25 min）、吗啡（半衰期 2～3 h）、秋水仙碱（半衰期20 min）等。此外，胆汁中毒药物代谢物的存在可为阳性结果确认提供可靠证据。因此，有学者认为仅依据血液筛查阴性结果而无胆汁筛查进一步补充确认时，其毒药物阴性结论的可靠性存疑。

3.2 死后再分布

对于死后再分布现象，通常认为通过尸体心血与外周血之间的毒药物浓度比可以评估是否有死后再分布发生[138]。目前文献报道的死后再分布研究主要集中在二个层面：一是胆囊胆汁作为死后再分布的可能来源。MDMA的家兔实验研究结果显示[139]，死亡时胆汁浓度高于肝脏浓度，死亡后胆汁浓度随时间延长下降，而肝脏浓度则呈升高的趋势，表明胆囊胆汁中的毒药物可向低浓度的邻近组织扩散。另有海洛因静脉注射后根据胃吗啡浓度的检出结果提出胆汁释放、肠胃反流的假设。二是认为胃可能是胆汁死后再分布的主要来源[2]。De Letter等[139]通过将MDMA注入胃或气管（模拟胃食管反流）的方法模拟了这一过程。还有研究对死后的家兔用氯胺酮进行灌胃，取灌胃后96 h内的胆汁进行分析[140]。上述研究结果显示当胃内存在高浓度的外源性毒药物时，胆囊会受到轻微的污染，胃内的毒药物会向左侧肝脏和胆囊扩散，但对胆囊的扩散程度要小于肝脏，同时研究显示随着时间的推移胃内毒药物向较低浓度的邻近组织中扩散呈现降低的趋势。研究结果表明，如死亡时胃内毒药物处于吸收相或吸收不完全，则可能构成毒药物的储备源。

3.3 局限性

相较于血液及尿液，胆汁的局限性首先体现在采样较为复杂。胆汁的可获得性取决于胆囊的完整性，取样时不仅要考虑进餐时间与死亡时间的关系，还需考虑胆汁可能会受到肝胆疾病或死亡过程的影响，例如因肝病变、胆囊炎、胆结石等疾病而造成胆汁分泌物的改变或因胆囊损伤后血管周围扩散或脱水情况而造成胆汁成分的改变[2]。其次胆汁排泄途径与毒药物分子量、亲脂性和对肝细胞膜转运体的亲和力有关，适用范围仍需进一步考察。再者部分目标物胆汁与血液中的浓度显示出弱相关性及分散性结果，故无法仅依据胆汁浓度外推血液浓度。现有研究表明胆汁与血液浓度的相关性会受到死亡时间、药物间的相互作用等因素的影响，因此，在依据胆汁浓度进行解释时，必须谨慎或使用统计学的方法来由胆汁外推血液中的浓度，从而估计不确定性。

4 展望

在毒物鉴定实践中，当血液检材缺失、污染或因受其他因素影响（毒物暴露水平较低、毒物半衰期较短）导致鉴定结果可靠性存疑时，需要寻找适宜的替代检材。胆汁较血液具有较长的检测窗口，对半衰期较短的毒物有明显的检测优势。同时，因其自身成分的性质决定了胆汁不易滋生细菌，产生污染。另外，部分研究显示，胆汁与血液浓度之间存在着显著的相关性且其受死后再分布影响较小。综上，胆汁可以作为较为理想的替代检材为血液中毒物浓度分析提供补充及质量控制，其在死后毒物学领域具有优势和潜在的应用价值。

目前，部分国家仍将胆汁作为法医毒物鉴定的常规检材，而国内关于胆汁中毒物分析的研究还较少。因此，对于胆汁在鉴定实践中的研究及应用尚有待深入与推广。