◎ 张 波，陆 健

（1.浙江经贸职业技术学院应用工程系，浙江 杭州 310018；2.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）

“以麦制曲，用曲酿酒”是中国黄酒的特色，也是黄酒酿造过程中的一项传统工艺[1]。黄酒企业为适应黄酒现代化生产的需要，在20世纪60年代开始推广应用熟麦曲。熟麦曲就是将小麦蒸熟后，杀死原料中的微生物，接种纯种的米曲霉进行培养，制曲过程中调节温湿度，供给空气，促使米曲霉在曲料上生长繁殖并积累代谢产物[2]。熟麦曲制曲时间短、且淀粉酶、蛋白酶活较高，在黄酒酿造过程中，能加快黄酒发酵，生产效率高。但由于微生物单一，所酿造黄酒口味寡淡，香气较差[2-3]。

黄酒麦曲中存在多种蛋白质，特别是酶蛋白，是麦曲实现其功能的重要基础。目前，国内直接针对黄酒熟麦曲中酶蛋白的研究开展较少，主要集中在淀粉酶、蛋白酶等，其手段大多为蛋白纯化和酶活测定[4-5]。此类方法对于同工酶的构成及其来源等无法获得，更谈不上从整体上获取麦曲中蛋白质组成的信息[4-6]。宏蛋白质组学技术是以一个细胞、组织或有机体中所有蛋白质为研究对象，从整体来分析蛋白质组成及活动变化规律[7]。宏蛋白质组学技术为研究黄酒麦曲中蛋白质组成及功能提供了思路和方法。

宏蛋白质组学技术主要包括蛋白质的提取和分离，质谱鉴定、数据库的检索分析。其中，双向凝胶电泳根据蛋白质等电点和相对分子质量的不同可以有效分析样品中的复杂蛋白[7-9]。由于双向凝胶步骤繁琐、电泳实验周期长、干扰因素较多，对后期蛋白质的质谱鉴定的准确度和重现性有直接影响[5]。因此，对于黄酒熟麦曲样品，需摸索出专用的实验条件，建立一套稳定性强、分辨率高和重复性好的宏蛋白质组的样品制备方法。

1 材料与仪器

①实验材料。熟麦曲，浙江古越龙山酿酒有限公司提供。②实验试剂。样品制备、双向电泳所用部分试剂见孔令琼[4]的相关研究。③实验仪器。微量高速冷冻离心机（Pico & Fresco17），Thermo公司生产。等电聚焦电泳仪（Ettan IPGphor 3）、垂直电泳系统（Ettan DALTsix）和扫描仪（ImageScanner）均为GE公司仪器。紫外可见分光光度计（UV-2100型），UNICO仪器有限公司。

这段历史让NIH前院长哈罗德·瓦默斯（Harold Varmus）对2025年的目标持有谨慎态度。他说：“没有人否认对阿尔茨海默病的研究亟须取得进展，但是我希望不要对其限定日期。”

2 实验方法

2.1 样品制备

参照GE公司《双向电泳操作手册》进行水化上样和等电聚焦[5]。

2.2 双向电泳实验分析

①麦曲浸提液的制备。称取10 g熟麦曲，加入25 mL 0.1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH 4.2），1片复合酶抑制剂，在4 ℃条件下浸提过夜。②使用4层纱布过滤，粗滤液以12 000 r/min转速，4 ℃条件下离心0.5 h，上清液即为麦曲浸提液。③使用0.22 μm的微孔滤膜过滤麦曲浸提液，过滤两次，所得滤液进行超滤浓缩。④样品进行沉淀处理，去除核酸、脂肪、糖类等杂质。⑤蛋白质样品加入合适体积的水化液，充分溶解后，使用RC-DC蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度[4]。

蛋白质上样量的高低直接影响双向电泳图谱的质量。蛋白质上样量低，导致样品蛋白无法在电泳图谱中完全呈现。蛋白质上样量过高，会导致双向电泳过载，有条纹的存在，电泳图谱中蛋白点重合[10]。本实验中称取一定量0.1mol/L pH4.2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液获得麦曲浸提液，使用Clean Up Kit试剂盒去除浸提液中核酸、脂肪、糖类等杂质，使用RC-DC蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度。分别控制上样量为20μg和90μg熟麦曲浸提蛋白，进行双向电泳实验，并经凝胶染色、脱色，扫描结果如图2所示。

3 结果与分析

3.1 不同样品处理方法对双向电泳结果的影响

分析图谱1发现，使用Clean Up Kit试剂盒法相对丙酮法所获得图谱质量较好，所获得蛋白斑点数目相对较多，蛋白质点较为清晰，而且水平和垂直方向拖尾现象不明显。而丙酮法所检测到的蛋白点较少，并且图谱中有明显的水平和垂直条纹。所以，使用Clean Up Kit试剂盒能够去除大量的干扰物质，电泳聚焦方面优于丙酮法。

图1 不同样品处理方法所获得的双向电泳图谱图

熟麦曲是将小麦碾碎后接种米曲霉纯种发酵而成。使用0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液来浸提麦曲，浸提液中除了可溶性蛋白质，还有脂肪、核酸、糖类、盐离子等干扰物质的残留，严重影响等电聚焦，从而影响双向电泳结果。如多糖类物质（尤其是带有电荷类的多糖），往往会导致双向电泳图谱中出现条纹，溶液中盐离子浓度过高的话，可能导致等电聚焦失败等[7-8]。因此，除去样品中杂质是非常必要的步骤。本研究采用丙酮法和Clean Up Kit试剂盒两种不同的样品处理方法来去除麦曲浸提液中的盐离子、多糖类等干扰电泳效果的杂质，经过样品处理的蛋白经过双向电泳实验，凝胶染色脱色后图谱如图1所示。

3.2 不同上样量对双向电泳结果的影响

①胶条水化。吸取125 μL麦曲样品水化液加入泡胀盘中，放置7 cm、pH 3～10 NL胶条水化过夜（12 h）。②第一向等电聚焦。水化过夜后的胶条用水冲洗干净后转移到胶条槽中，进行等电聚焦。③胶条平衡。等电聚焦结束后，将胶条用水冲洗干净后，放置到平衡液中，经过两次平衡，每次平衡15 min。④SDS-PAGE电泳。配制12.5%分离胶，以恒流进行电泳，开始时10 mA，等蛋白完全从胶条中转移到凝胶中后，再以20 mA电泳至溴酚蓝迁移至凝胶最底部，电泳结束。⑤凝胶染色。电泳结束后剥离凝胶，置于固定液固定1 h后，换到考马斯亮蓝染色液中染色4 h，换脱色液中脱色，直至凝胶背景清晰。⑥凝胶扫描。使用Image ScannerIII凝胶成像系统对染色好的凝胶进行扫描并保存图像。

图2 不同上样量的熟麦曲双向电泳图谱

由图2可知，上样量较低时，蛋白点聚焦较好，蛋白点数目较少，只有24个蛋白点。上样量90μg左右时，蛋白点的数目较多，存在有94个蛋白点，但有4个蛋白点丰度较高，几乎要覆盖其他蛋白点。绝大部分的蛋白点是分布在酸性端。后期可以考虑使用pH4～7胶条来进行双向电泳实验，以获得更高分辨率的图谱。

检索出相关文献138篇，剔除重复发表的、阅读摘要及全文，共筛选出16篇RCTs，纳入1 745例患者，其中低剂量组900例，标准剂量组845例。文献质量评价8篇为B级[3,8,13,15,17,18,20,22]，其余均为C级，纳入文献特征见表1。

高温高密度泥浆技术、高压差堵漏技术、高温高强度固壁技术以及垂钻技术(或纯机械式垂钻系统)+取心技术实现长裸眼井段钻进；泥浆材料以及高温孔底仪器和钻具满足175℃要求；堵漏和固壁材料满足250℃要求。

4 结论

蛋白质的提取与分离是宏蛋白质组学的核心技术之一。本研究利用pH4.2醋酸-醋酸钠缓冲溶液浸提黄酒熟麦曲中所有可溶性蛋白，双向电泳技术对蛋白质进行分离。通过一系列实验，对影响双向电泳结果的关键条件进行研究，初步建立了适合于绍兴黄酒熟麦曲的宏蛋白质组的样品制备方法体系。

2012年1月15日，湖南省汝城县小型农田水利重点县建设项目在该县土桥镇黄家村正式启动。据了解，该项目总投资达到17140万元，雄厚的资金为汝城的农田水利基本建设注入强劲的发展动力。

影响样品制备结果的因素很多，包括实验材料的选择、样品处理的方法、样品上样量、等电聚焦程序、试剂的纯净度及操作人员的熟练程度等。其中，样品处理方法是样品制备成功的关键程序，样品处理方法如果选择不当，会造成浸提液中大量盐离子和多糖类物质残留，影响双向电泳结果。本研究中对比了丙酮法和Clean Up Kit试剂盒法来处理麦曲浸提液，发现Clean Up Kit试剂盒法能够有效去除盐离子、多糖等干扰物质，蛋白点数目较多且清晰，无拖尾现象。而丙酮法蛋白点较少且存在水平和垂直方向的条纹。因此，样品处理方法选择Clean Up Kit试剂盒来去除杂质。样品上样量也是影响样品制备的关键因素之一。低上样量会导致样品中蛋白点呈现不完全，高上样量会导致双向电泳过载，蛋白点重合，有横纵条纹存在，甚至是拖尾。对于本研究中使用的长度为7 cm，pH值为3～10非线性的IPG胶条，当蛋白质的上样量为90μg时，分离效果较好。

5 结语

通过一系列实验，本研究初步建立了适合绍兴黄酒熟麦曲的宏蛋白质组的样品制备方法体系，得到了分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱，为进一步分析熟麦曲中所有可溶性蛋白的组成和来源奠定了基础。