韦显凯 覃晴 祝健 唐海波 梁晶晶 李晓宁 罗廷荣

摘要：【目的】建立Toll樣受体3（TLR3）基因缺失的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系，为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据。【方法】采用Golden Gate Kit试剂盒组装转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）打靶载体pTALEN-TLR3，经酶切和测序验证其连接正确后，通过脂质体瞬时转染RAW264.7细胞，转染后提取细胞DNA，用T7核酸内切酶酶切验证TALEN质粒剪切活性。【结果】TALENs左右臂分两部分连接，首先完成A、B部分的各自连接，然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接，TALEN模块经过两次连接后的PCR鉴定结果显示，T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性，T2R有3个克隆呈阳性。T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后提取DNA为模板，经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切，酶切后的DNA电泳结果显示TALEN2剪切活性较强，共获得3条条带（931、555和376 bp）。TALEN打靶载体pTALEN-TLR3转染RAW264.7细胞24 h后用胰酶进行消化，并加入800 μg/mL G418进行筛选，7 d后获得细胞单克隆；挑选阳性细胞克隆进行T7核酸内切酶酶切鉴定及测序，结果发现4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系，均缺失7 bp的核苷酸碱基，为非3整数倍碱基缺失，可造成后续基因移码突变，使细胞基因功能失活。【结论】通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系，且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究。

关键词： 狂犬病毒；RAW264.7细胞；转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）；Toll样受体3（TLR3）；基因敲除

中图分类号： S852.33 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）05-0993-07

Abstract：【Objective】The aims of this experiment was through establishing macrophage RAW264.7 cell line lacked Toll-like receptors 3（TLR3） gene to provide theoretical basis for exploring the role of TLR3 in inherent immunity during the process of rabies virus infection. 【Method】The Golden Gate Kit was used for constructing transcription activation effect factor nuclease（TALEN） targeting vector pTALEN-TLR3， and correctness was verified by enzyme digestion and sequencing， RAW264.7 cells by were transiently transfected liposome， and the cells DNA was extracted after transfection， then the shear activity of pTALEN-TLR3 was verified with T7 nucleic acid enzyme. 【Result】The connection of left arm and right arm of TALENs was constructed by two steps. In the first step， part A and B were connected separately. Then T1LA and T1LB， T1RA and T1RB， T2LA and T2LB， T2RA and T2RB were connected separately. After the two steps， TALEN module was identified by PCR， the results show that all the four clones of T1L， T1R and T2L were positive， three clones of T2R were positive. The T2L and T2R plasmids were co-transfected to RAW264.7 cells， and then DNA was extracted as template，which was implemented in enzyme digestion by T7 nucleic acid endonuclease after PCR amplification. The DNA electrophoresis results after enzyme digestion showed that TALEN2 shear activity was strong， and three bands（931， 555 and 376 bp） were obtained. RAW264.7 cells were transfected with the TALEN2-TLR3， and then digested with pancreatic enzymes after 24 h， and were screened by adding 800 μg/mL G418， a single clone was obtained after 7 d. The positive cell clones were chosen for identification and sequencing by T7 endonuclease digestion. The results showed that No.4-1 and 4-40 clone cells were double knockout cell lines， they all missed 7 bp nucleotide bases， as non-three integer times base deletion. It could cause subsequent frame shift mutations， and inactivated gene function of the cell. 【Conclusion】RAW264.7TLR3-/- cell line from macrophages of mice with the double knockout of TLR3 gene was constructed successfully by TALEN technology. This can be applied for further study on the relationship between cytokines and TLR3 after rabies virus infects cells.

Key words： rabies virus； RAW264.7 cell； transcription activation effect factor nuclease（TALEN）； Toll-like ceptors 3（TLR3）； gene knockout

0 引言

【研究意义】Toll样受体3（Toll-like receptors 3，TLR3）位于细胞内膜上，是机体识别外源病原体的重要受体，通过特异性识别双链RNA（dsRNA）而激活细胞内信号转导通路并活化特定的细胞因子，最终诱导产生干扰素（IFN）（Beutler，2003）。狂犬病毒感染动物机体或细胞后能通过TLR3刺激宿主产生I型干扰素（Chopy et al.，2011；王攀等，2017），而I型干扰素通过与细胞膜上的特异受体结合，引发级联性的信号并传递到细胞核内，对一系列干扰素刺激基因的表达进行调控，诱导靶细胞产生特异性抗病毒蛋白（李军和曾芸，2006）。因此，通过敲除小鼠巨噬细胞RAW264.7的TLR3，对研究狂犬病毒感染RAW264.7细胞后的细胞因子产生通路具有重要意义。【前人研究进展】转录激活样效应因子（Transcription activator-like effector，TALEs）是一种能与DNA结合的天然蛋白，最初在植物黄单胞菌中发现，可通过Ⅲ型分泌系统进入宿主细胞，也被称为Ⅲ型效应物（Jiang et al.，2013）。TALEs通过其独特结构能与DNA特异性结合（Moscou and Bogdanove，2009），结合部位是由7～34个高度同源的重复单元组成，尤其是重复单元的第12和13位氨基酸对DNA的特异性识别起重要作用（Mak et al.，2013）。重复单元由N端开始到C端结束，其排列顺序与识别的DNA双链5'端到3'端的碱基顺序一致，一个重复单元的双氨基酸残基（Repeat variant diresidue，RVD）特異识别一个碱基对（曲晓辰等，2016）。TALEs可特异性识别任意设计的DNA序列，配合核酸酶、转录因子或同源重组序列，实现生物体内的基因靶向操作，包括基因敲除、同源重组和基因激活等，同时可调节目的基因转录（Geissler et al.，2011；Miller et al.，2011；Sanjana et al.，2012）及对基因组进行编辑（Bogdanove and Voytas，2011；Tesson et al.，2011）。因此，TALEN技术是一种新型的基因敲除方法（Christian et al.，2010）。此外，识别特异DNA序列的TALE与核酸内切酶Fok I偶联，构建获得剪切特异DNA序列的内切酶转录激活样效应因子核酸酶（TALEN），将其转入细胞中可实现靶基因敲除（Mussolino et al.，2011）或DNA定点修饰（Christian et al.，2010；Mahfouz et al.，2011；Morbitzer et al.，2011）。Toll样受体（TLR）是固有免疫中高度保守病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）的特异性模式识别受体，通过识别微生物的保守序列而在炎症反应及机体固有防御体系中发挥重要作用。其中，TLR3可识别dsRNA及病毒复制过程中产生的中间复合物，活化IFN-α/β而限制感染部位病毒的复制，形成局部抗病毒状态（Krishnan et al.，2007）。Chen等（2016）研究发现，猪圆环病毒2型（PCV2）感染能显著上调体外培养猪肺泡巨噬细胞中TLR3的表达；王鹏飞等（2016）研究表明，抗蓝耳病猪肺组织中的TLR3基因表达量显著高于易感蓝耳病猪，即TLR3基因高表达可能与猪对蓝耳病的抗性有关；姜雪婷等（2017）研究表明，PCV2感染猪后第7和14 d，TLR3 mRNA与蛋白表达显著上调。【本研究切入点】小鼠巨噬细胞RAW264.7是由鼠白血病病毒诱导后得到的细胞株，具有很强的黏附和吞噬抗原能力，是动物体内重要的免疫应答细胞之一，在适应性免疫和固有免疫中发挥重要作用（Beutler，2003）。因此，RAW264.7细胞适用于狂犬病毒感染后产生的固有免疫相关细胞因子研究。【拟解决的关键问题】以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型，建立TLR3基因双敲除细胞系，并通过TALEN打靶载体的构建及验证，瞬时转染RAW264.7细胞后用于TLR3-/-细胞系筛选，为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

RAW264.7细胞由广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室保存提供，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中；胎牛血清、DMEM和脂质体（Lipofectamine 2000）购自美国Life公司，PCR Buffer和DNA Marker等试剂购自TaKaRa公司，荧光倒置显微镜购自日本Nikon公司。

1. 2 TALEN载体构建

1. 2. 1 TALEN打靶位点设计 根据小鼠TLR3基因序列，标注出基因外显子及内含子范围，在翻译起始位点所在的外显子处寻找限制性内切酶位点并设计TALEN载体（TALEN1和TALEN2），进行基因敲除，TALEN载体设计原理见图1。

1. 2. 2 TALEN模块组装 根据TALEs蛋白的重复可变RVD与碱基的对应关系，组装TALEN模块。RVD组装采用Golden Gate Kit试剂盒，TALEN打靶载体pTALEN-TLR3构建采用Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit试剂盒。

1. 2. 3 TALEN模块连接 TALENs左右臂分两部分连接：首先是完成A、B部分的各自连接（以下分别称为T1LA、T1LB、T1RA、T1RB和T2LA、T2LB、T2RA、T2RB），然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接，即完成TALEN第二次连接。

1. 2. 4 TALEN质粒剪切活性验证 通过脂质体方法以TALEN打靶载体pTALEN-TLR3瞬时转染RAW264.7细胞，转染后提取细胞DNA为模板，经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切，并检测目的基因完整性以验证TALEN质粒剪切活性。

1. 2. 5 基因敲除细胞系筛选 细胞转染：以具有基因剪切活性的TALEN2进行细胞筛选，细胞培养生长至70%汇合度时进行脂质体转染。细胞筛选及培养：转染24 h后用胰酶EDTA消化液消化RAW264.7细胞，稀释后转入新的细胞板，同时加入800 μg/mL G418进行筛选，当出现单克隆时，挑取单克隆至96孔板中培养，长满后扩大至48孔中继续培养，细胞汇合生长至80%～90%时，胰酶消化后挑取一半的细胞提取DNA，然后PCR扩增目的片段并进行酶切鉴定，剩余细胞在原孔培养。阳性克隆酶切鉴定：采用T7核酸内切酶酶切鑒定RAW264.7细胞是否为TLR3基因双敲除，其过程需经过两轮PCR扩增和酶切。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行30个循环；72 ℃延伸10 min。第一轮细胞裂解扩增出目的条带后，PCR产物采用T7核酸内切酶进行酶切鉴定，出现与预期结果一致的两条剪切产物，此为单敲细胞克隆；将T7核酸内切酶未能切开PCR产物的细胞克隆再次进行PCR扩增，与野生型细胞PCR扩增产物1∶1混合后，以T7核酸内切酶进行酶切鉴定，出现大小吻合的酶切产物，即为双敲细胞克隆。测序鉴定：提取酶切鉴定为TLR3基因双敲除的细胞克隆DNA，PCR扩增打靶位点及其上、下游目的基因，产物与pMD18-T载体连接，挑取8个阳性克隆送至深圳华大基因公司测序，在线比对分析测序结果，全为非3整数倍缺失的细胞克隆即为所需的基因纯合敲除细胞系。

2 结果与分析

2. 1 TALEN模块第一次连接及PCR鉴定结果

TALENs左右臂分两部分连接，第一次完成A、B部分的各自连接。连接完成后即转化感受态细胞并涂布于含氨苄青霉素的琼脂培养基上，每个培养基挑3～5个克隆进行PCR鉴定，鉴定结果出现弥散条带即为阳性（图2）。

2. 2 TALEN模块第二次连接及酶切鉴定结果

分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接，转化涂板后挑克隆进行PCR鉴定，若出现弥散条带即为阳性（图3-A）。挑取阳性菌落提质粒后，用限制性内切酶Xho I和Afl II进行酶切鉴定，获得的目的条带大小约3000和4000 bp（图3-B）。TALEN模块第二次连接后的菌液PCR鉴定结果显示，T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性，T2R有3个克隆呈阳性。

2. 3 TALEN质粒剪切活性验证结果

2. 3. 1 脂质体转染结果 取鉴定正确的一个T2L和T2R进行下游试验。RAW264.7细胞培养于12孔板（2孔），通过脂质体方法以TALEN打靶载体pTALEN-TLR3进行瞬时转染。其中一孔转染EGFP（增强绿色荧光蛋白）质粒作为对照，以观察转染效率；另一孔共转染T2L和T2R质粒。pEGFP-N1转染RAW264.7细胞17 h后，EGFP表达出强荧光信号（图4），表明RAW264.7细胞转染成功。

2. 3. 2 T2L/T2R酶切鉴定活性 T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后，通过检测目的基因完整性以验证TALEN质粒剪切活性。本研究中，TALEN2活性鉴定结果显示其活性较强，酶切后的DNA电泳条带显示出3条条带（931、555和376 bp）；而TALEN1活性较弱（图5），故选取TALEN2进行后续试验。

2. 4 基因敲除细胞系筛选结果

2. 4. 1 细胞克隆筛选 转染24 h后用胰酶消化RAW264.7细胞，稀释后转入新的细胞板，同时加入800 μg/mL G418进行筛选，7 d后获得单克隆（图6）。

2. 4. 2 阳性克隆酶切鉴定结果 在挑取的189个细胞克隆中有166个克隆的裂解液能扩增出明显条带。部分细胞克隆两轮PCR扩增产物的T7核酸内切酶酶切结果如图7所示。其中，4-1和4-40号细胞克隆在第一轮PCR中只有扩增条带，在第二轮PCR中出现两条清晰且大小吻合的目的条带，为纯合敲除；4-48号细胞克隆在第一轮PCR中也只有扩增条带，在第二轮PCR中出现两条模糊的目的带，为疑似纯合敲除，测序后确定为单敲细胞系。其余细胞克隆均为单敲细胞系。

2. 5 双敲细胞系的测序鉴定结果

测序鉴定结果表明，4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系，均缺失7 bp的核苷酸碱基（图8），为非3整数倍碱基缺失，可造成后续基因移码突变，使细胞基因功能失活。

3 讨论

TALEN技术作为一种新的基因修饰方法，除了用于阳性细胞系的筛选，现已成功应用于植物基因修饰及动物模型产生（Morbitzer et al.，2010）。通过TALEN技术构建基因敲除动物模型的研究进一步拓宽了其应用于遗传工程的前景，尤其对于一些不能利用传统基因敲除方法进行敲除的基因，可利用TALEN技术进行敲除。在本研究中，通过TALEN打靶载体切割获得两个单敲细胞系，分别缺失5和86 bp的核苷酸碱基，而双敲细胞系仅缺失7 bp的核苷酸碱基。尽管TALEN载体在体内具有很高的切割活性，但由一对TALEN载体切割只会引起小范围的片段丢失（Ma et al.，2012）。因此，本研究在利用一对TALEN载体对TLR3进行基因敲除的基础上，采用两对TALEN载体同时对基因组进行修饰，从而为机体内非编码序列及假基因进行整体功能研究提供了新方法。TALEN载体组装方式便捷，切割效率高，毒性低，其活性在斑马鱼（Sander et al.，2011）、线虫（Sanjana et al.，2012）、鼠（Tong et al.，2012）、人类（Ding et al.，2013）及多能干细胞（Hockemeyer et al.，2011）中均已得到验证，但在实际应用中仍需注意基因脱靶现象的发生。

本研究中，TALEN打靶载体pTALEN-TLR3转染RAW264.7细胞48 h后收集提取DNA，用T7核酸内切酶进行活性鉴定。T7核酸内切酶酶切鉴定TALEN质粒活性的原理：当TALEN质粒作用于靶位点时，会在Spacer位置将DNA双链切断，导致部分碱基缺失或改变，将这一序列扩增下来再变性—复性，PCR扩增产物中的野生型序列和突变型序列会退火形成双链，由于剪切位置碱基改变，无法碱性互补，而形成泡状的DNA结构，T7核酸内切酶则可特异性地切断泡状单链，将PCR扩增产物剪切成两段，因此经T7核酸内切酶酶切后电泳条带显示出3条条带。TLRs属模式识别受体，是一个非常重要的天然免疫分子，广泛分布于免疫细胞及上皮细胞表面，通过识别不同病原体的PAMP而在天然免疫中发挥重要作用。TLRs与PAMPs相互作用引发的信号传导能导致炎症介质的释放，并最终激活获得性免疫系统（Ding et al.，2013）。当机体受到病原微生物刺激時，I型干扰素参与天然免疫反应，抵抗病毒感染，而TLR3是调节I型干扰素表达的关键转录因子（Jiang et al.，2014；Satoh and Akira，2016）。目前已检测到多种细胞表达TLRs，包括不同的树突状细胞（DCs）亚群、T淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、单核细胞及多种上皮细胞，CD4+CD25+调节性T淋巴细胞也有TLRs表达（Gururajan et al.，2007；Kawai and Akira，2009）。因此，利用TLR3基因双敲除构建的TALEN打靶载体pTALEN-TLR3不仅适用于小鼠巨噬细胞的阳性细胞系筛选，还可运用到所有能表达TLRs的细胞中。

RAW264.7细胞是由鼠白血病病毒诱导后得到的稳定传代细胞株。巨噬细胞作为机体固有免疫系统中的重要效应细胞，其效应蛋白及抗原递逞功能负责防御不同的病原体（Yao et al.，2015；李辉等，2016）。巨噬细胞表达多种模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR），且能特异性识别PAMP而有效监测病原微生物的入侵及诱导机体免疫应答反应（Rhule et al.，2006）。TLRs激活可诱导巨噬细胞产生炎症因子，促进炎症反应的发生。TLR3存在于中枢神经系统中（Alexopoulou et al.，2001），当神经退行性疾病或病毒侵染大脑后，中枢神经系统的胶质细胞及神经元中存在高水平的TLR3（Farina et al.，2005），说明TLR3在神经损伤性病毒感染过程中发挥重要作用（Jackson et al.，2006）。TLR3对狂犬病毒侵染神经元细胞形成尼氏小体的过程也起重要作用（Ménager et al.，2009），但目前关于TLR3在狂犬病毒与宿主相互作用过程中的作用机制尚未明确。本研究通过TALEN技术成功构建了双敲除TLR3基因的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系，为下一步研究狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系打下基础。

4 结论

通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系，且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究。

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（責任编辑 兰宗宝）