磨正遵 商飞飞 潘中田 张丽鲜 李思思

摘要：【目的】優化超声波辅助提取广西大果山楂叶黄酮的工艺条件，为广西大果山楂叶资源的开发利用提供技术参考。【方法】以广西大果山楂叶为原料，以超纯水为提取剂，通过单因素及响应面试验对超声波辅助提取山楂叶黄酮工艺进行优化，探讨超声波功率、提取温度、提取时间和料液比4个因素对黄酮提取率的影响。【结果】通过响应面试验建立二次多项回归方程：Y=52.91+1.41A+1.08B+1.63C+0.51AB+0.89AC+0.052BC-4.53A2-0.97B2-1.36C2（Y为黄酮提取率，A为提取温度，B为提取时间，C为料液比）。超声波辅助提取广西大果山楂叶黄酮的最佳工艺条件为：超声波功率140 W、提取温度59 ℃、提取时间120 min、料液比1∶56（g/mL），在此条件下黄酮提取率为54.18 mg/g，与预测值53.86 mg/g的误差小。3个因素对广西大果山楂叶黄酮提取率影响主次排序为料液比>提取温度>提取时间，提取温度与料液比的交互作用对山楂叶黄酮提取率有显著影响（P<0.05）。【结论】响应面优化得到的超声波辅助水提广西大果山楂叶黄酮工艺具有提取率高、精度高、工艺稳定的优点，可在生产中推广应用。

关键词： 广西大果山楂叶；黄酮；超声波辅助提取；响应面法

中图分类号： S661.5 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）05-0986-07

Abstract：【Objective】The technology condition of ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Guangxi big fruit hawthorn leaves was optimized in order to provide technical reference for the resource utilization of Guangxi big fruit hawthorn leaves. 【Method】The ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from hawthorn leaves was optimized by using single factor and response surface test， taking the Guangxi big fruit hawthorn leaves as the raw material， and ultra-pure water as the extractant. The effects of four factors including ultrasonic power， extraction temperature， extraction time and solid liquid ratio on extraction rate of flavonoids were studied. 【Result】According to response surface test， the quadratic regression model equation was established：Y=52.91+1.41A+1.08B+1.63C+0.51AB+0.89AC+0.052BC-4.53A2-0.97B2-1.36C2（Y referred to the extraction rate of flavonoids； A referred to extraction temperature； B referred to extraction time； and C referred to solid liquid ratio）. The optimum technology conditions for ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from big fruit hawthorn leaves were as follows：the ultrasonic power was 140 W； the extraction temperature 59 ℃； extraction time 120 min and solid liquid ratio 1∶56（g/mL）. Under such conditions，the extraction rate of flavonoid was 54.18 mg/g and the error was small compared with the predictive value（53.86 mg/g）. According to importance order， the influence of the three factors on the extraction rate of flavonoids from Guangxi big fruit hawthorn leaves was solid liquid ratio> extraction temperature>extraction time. And the interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio had significant influence on the extraction rate of flavonoids from hawthorn leaves（P<0.05）. 【Conclusion】The ultrasonic-assisted water extraction optimized by response surface has following advantages：high extraction rate， high precision and stable technology， so it can be used for the promotion and application in production.

Key words： Guangxi big fruit hawthorn leaf； flavonoids； ultrasonic-assisted extraction； response surface methodology

0 引言

【研究意义】山楂为蔷薇科山楂属，在我国广西、广东、云南、河南和山东等地种植，是我国特有的药果兼用树种之一。其品种通常分为南北山楂两类，山里红称为北山楂，野山楂俗称南山楂，果实直径1.0～1.5 cm。山楂叶化学成分主要为三萜类和黄酮类物质，其中黄酮类具有降血脂（苏曼曼等，2007）、降血糖、预防肝损伤（郭菁菁和杨秀芬，2008）、抗氧化（曹剑锋等，2016）及提高机体免疫力（房磊，2016）等生理活性。广西大果山楂属于南山楂的一种，由小果南山楂经选育嫁接而成，与普通山楂相比，大果山楂果粒大，最大可达300 g，直径在4.0～6.0 cm；大果山楂叶呈绿色尖状，与北山楂叶的多棱角状不同，且含有较多的有益成分，在2015年版《中国药典》中再次被收录。据统计，2016年广西大果山楂种植面积超过1.67万ha（陈兵兵等，2017）。广西大果山楂在收果后，山楂叶常被丢弃，造成环境污染及资源浪费。因此，研究大果山楂叶黄酮的提取方法，可为大果山楂叶综合开发利用提供途径，解决不合理的资源浪费。【前人研究进展】前人对山楂黄酮的提取已有不少研究报道。韩秋菊（2011）以乙醇为提取溶剂，通过单因素及正交试验优化微波提取山楂黄酮工艺，得到黄酮提取率34.7 mg/g；李宁豫等（2013）以乙醇为提取溶剂，采用正交试验优化超声辅助提取山楂黄酮工艺，在固液比1∶20、乙醇体积分数80%、超声功率60 W、超声时间25 min的条件下得到黄酮提取率为4.11%；施红林等（2014）利用响应面分析法优化乙醇提取山楂叶中黄酮，在最佳工艺条件（液固比29∶1 mL/g、乙醇体积分数68%、提取温度64 ℃、提取时间34 min）下黄酮粗提取率为30.7 mg/g；夏成凯等（2014）采用乙醇与醋酸乙酯混合法对山楂叶黄酮进行提取；刘伟等（2016）对比常温浸提、索氏提取和超声提取3种方法提取准噶尔山楂叶总黄酮的效果，结果发现超声提取法较其他两种提取法操作简单、耗时少、提取效率高。【本研究切入点】目前，前人对北方品种的山楂叶研究较多（施红林等，2014；夏成凯等，2014；刘伟等，2016），且大多采用有机溶剂提取，极易造成环境污染，而针对广西大果山楂叶黄酮水提工艺的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以自然晒干的广西贺州大果山楂叶为试验材料、以水为提取溶剂，通过单因素试验和响应面法筛选出超声波辅助提取广西大果山楂叶黄酮的最佳工艺条件，为更好地利用广西山楂资源提供技术参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

山楂叶采摘于贺州学院大果山楂种植基地，烘干后粉碎，过80目筛。芦丁对照品（含量>98%）购自上海金穗生物科技有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠均为国产分析纯。主要仪器设备：DFY-600高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）、DHG-9140A电热鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、KQ-5200DV超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、UV1901PC紫外可见分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）、L-550离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、BSA124S电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]、Advanced-II-40超純水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 工艺流程 准确称取1.00 g山楂叶粉末样品置于小烧杯中，加入适量水溶液，在一定超声波功率下提取一定时间后冷却至室温；然后离心，收集上清液于100.0 mL容量瓶定容；取2.0 mL提取液于25.0 mL容量瓶，测其吸光值。

1. 2. 2 芦丁标准曲线制作 取芦丁标准品粉末20.0 mg置于50.0 mL烧杯中，用60%乙醇溶解后倒入100.0 mL容量瓶中，再用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得到0.2 mg/mL芦丁溶液；移取芦丁溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL分别置于25.0 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶液至10.0 mL，然后分别加入1.0 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀后放置6 min；加入1.0 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min后再加入1.0 mL 4%氢氧化钠溶液，最后分别加入60%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后在500 nm波长下用分光光度计测其吸光值。以芦丁质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，制作标准曲线（赵跃刚等，2011）。

1. 2. 3 单因素试验 依次对影响广西大果山楂叶黄酮提取效果的4个因素进行单因素试验，以获得各因素适宜水平值。每个单因素试验得到的最优值作为下一组单因素的固定条件值，每个试验重复3次。

超声波功率选择：固定料液比1∶32（g/mL，下同）、提取时间60 min、提取温度50 ℃，分别在120、140、160、180和200 W下提取广西大果山楂叶黄酮。提取温度选择：固定料液比1∶32、超声波功率140 W、提取时间60 min，分别在35、40、50、60、70和80 ℃下提取黄酮。提取时间选择：固定料液比1∶32、超声波功率140 W、提取温度50 ℃，分别在30、60、90、120、150和180 min下提取黄酮。料液比选择：固定提取时间120 min、超声波功率140 W、提取温度50 ℃，分别在1∶16、1∶24、1∶32、1∶40、1∶48和1∶56下提取黄酮。

黄酮提取率（mg/g）=C×V/W

式中，C为黄酮质量浓度（mg/mL），V为提取液体积（mL），W为山楂叶样品质量（g）。

1. 2. 4 响应面试验 在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心设计方法设计响应面试验，确定广西大果山楂叶黄酮超声波辅助提取最佳工艺条件。以提取温度、提取时间和料液比为自变量，黄酮提取率为响应值，设17个处理组。试验水平设计见表1。

1. 2. 5 验证试验 在超声波辅助提取的最佳工艺条件下进行3次试验，验证提取条件优化的可靠性和稳定性。

1. 3 统计分析

采用Excel 2017处理试验数据，用OriginPro 8.5和Design-Expert 10.0制图。

2 结果与分析

2. 1 芦丁标准曲线

以芦丁质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线（图1），得到回归直线方程为y=20.9x-0.0001（R2=0.99985），吸光值线性范围为0～0.9992，标准曲线浓度范围内线性良好。

2. 2 单因素试验结果

2. 2. 1 超声波功率对广西大果山楂叶黄酮提取率的影响 由图2可知，在超声波功率120～200 W范围内，广西大果山楂叶黄酮提取率分别为41.54、42.80、39.53、41.10和41.09 mg/g，不同超声波功率对黄酮提取率的影响在2.00 mg/g之内，说明小范围内调整超声波功率对黄酮提取影响不明显。这是由于小功率范围内超声波产生的热效应较小，120～200 W超声波功率未对广西大果山楂叶黄酮造成破坏。综合考虑提取率和能耗等因素，选取140 W为最佳超声波功率进行后续试验。

2. 2. 2 提取温度对广西大果山楂叶黄酮提取率的影响 由图3可知，提取温度为50 ℃时，广西大果山楂叶黄酮提取率达最大值；提取温度在35～50 ℃时，黄酮提取率随提取温度的升高而逐渐增大；当提取温度在50～70 ℃时，随提取温度的升高黄酮提取率反而逐渐减小。这是因为以水作为溶剂提取黄酮时，随着提取温度的升高，分子热运动加剧，分子扩散速度增加，越来越多黄酮分子进入水中，但温度过高时，黄酮结构被破坏，导致黄酮损失。70 ℃之后黄酮提取率又增加，是由于提取温度70 ℃是临界值，在50～70 ℃提取率比损失率小，70～80 ℃的提取率比损失率大。综合考虑黄酮提取率和能耗等因素，选取40、50和60 ℃ 3个水平进行响应面试验。

2. 2. 3 提取时间对广西大果山楂叶黄酮提取率的影响 由图4可知，广西大果山楂叶黄酮提取率在提取时间为120 min时达最大值；提取时间小于120 min时，黄酮提取率随提取时间延长呈上升趋势，因为随着提取时间的延长，热运动增加，导致分子扩散速度加快。提取时间超过120 min后，黄酮提取率逐渐下降，是由于提取时间过长，热效应致使部分黄酮类化合物损失，从而影响提取率。综合考虑黄酮提取率和能耗等因素，选取90、120和150 min 3个水平进行响应面试验。

2. 2. 4 料液比对广西大果山楂叶黄酮提取率的影响

由图5可知，广西大果山楂叶黄酮提取率随提取溶剂用量的增大而增大，料液比为1∶16～1∶40的影响最明显。这是因为随着提取溶剂用量的增大，山楂叶粉末与水接触面积增加，加快了黄酮类化合物溶出，且水的用量越大，后续步骤耗能相应增加。综合考虑提取率和能耗等因素，选取1∶40、1∶48和1∶56 3个水平进行响应面试验。

2. 3 响应面分析法优化结果

在单因素试验的基础上，选取对广西大果山楂叶黄酮提取率影响明显的3个因素（提取温度、提取时间、料液比）进行响应面试验，利用Design-Expert 10.0對响应面试验结果（表2）进行多元回归拟合，得到山楂叶黄酮提取率（Y）对提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）的二次多项式回归模型：Y=52.91+1.41A+1.08B+1.63C+0.51AB+0.89AC+0.052BC-4.53A2-0.97B2-1.36C2。回归方程中二次项A2、B2和C2的系数均为负数，说明回归方程存在稳定点（姜晓娇和王承明，2010），即存在极大值。

对该模型进行方差分析，结果（表3）表明，回归模型P<0.0001，在a=0.01水平下为极显著，因变量和3个自变量间的线性关系极显著（R2=0.986），说明模型能解释98.6%的响应值变化，误差也较小，模型F为54.29814。通过观察回归方程可知，各因素间相互影响，由表3可知A、B、C、A2、B2和C2对山楂叶黄酮提取率影响极显著（P<0.01），AC对山楂叶黄酮提取率影响显著（P<0.05，下同），AB和BC均不显著（P>0.05，下同）。3个因素对广西大果山楂叶黄酮提取率影响主次排序为C>A>B，即料液比>提取温度>提取时间，交互作用的影响排序为AC>AB>BC。

2. 4 响应曲面图分析结果

料液比、提取温度和提取时间3个因素在反应过程中的相互作用见图6～图8。曲线走势越陡，表明该因素影响越显著；曲线走势越平滑，则表明该因素影响较小（赵强等，2012；李春荣等，2016）。等高线为椭圆形表示两因素的交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著。从图6～图8可看出，提取温度、料液比和提取时间图形曲线走势较陡，说明其影响显著；提取温度与提取时间、提取时间与料液比的等高线均呈圆形，说明两因素间的交互作用对黄酮提取率影响不显著；提取温度与料液比的等高线呈椭圆形，说明两者间交互作用对黄酮提取率影响显著。

2. 5 验证试验结果

由Design-Expert 10.0拟合得到超声波辅助提取广西大果山楂叶黄酮的最佳工艺参数为：超声波功率140 W、提取温度59.01 ℃、提取时间2.11 h、料液比1∶55.81。为方便实际操作，修正工艺参数为：超声波功率140 W、提取温度59 ℃、提取时间120 min、料液比1∶56，在此优化条件下进行3次验证试验，得到广西大果山楂叶黄酮提取率平均值为54.18 mg/g，与预测值53.86 mg/g误差小，表明优化工艺稳定，重复性好。

3 讨论

目前已有一些关于山楂黄酮提取工艺的研究，袁冬梅和李一婧（2007）利用甲醇结合微波提取山楂叶黄酮；周海旭等（2011）以乙醇为溶剂，利用响应面法优化山楂叶黄酮提取工艺；郭梅等（2012）通过正交试验优化微波辅助提取山楂中黄酮类化合物工艺，但这些研究均以有机溶剂为提取剂对黄酮进行提取，污染较高。本研究利用超纯水为提取剂，在实际生产中可避免有机溶剂造成的黄酮污染，一定程度上提高了水提法的生产效率，且污染程度低、不破坏有效成分，提取的黄酮可直接应用在软饮料或保健品中。

现有研究多采用正交试验优化山楂黄酮提取工艺（韩秋菊，2011；李宁豫等，2013；曹乐民等，2014），但正交试验无法在试验范围内确定影响因素的最佳组合和响应值的最优值。响应面法既能提供各影响因子的交互作用，又能确保试验值与理论值相差较小，具有精度高的特点（侯学敏等，2013；张昊等，2016）。本研究通过响应面试验优化超声波辅助提取广西大果山楂叶黄酮的工艺，建立了料液比、提取温度、提取时间3个因素对大果山楂叶黄酮提取率的回归模型：Y=52.91+1.41A+1.08B+1.63C+0.51AB+0.89AC+0.052BC-4.53A2-0.97B2-1.36C2。通过响应面优化分析得到黄酮提取最佳工艺条件为：超声波功率140 W、提取温度59 ℃、提取时间120 min、料液比1∶56，在此工艺下广西大果山楂叶黄酮提取率为54.18 mg/g，高于韩秋菊（2011）、李宁豫等（2013）采用正交试验优化提取工艺获得的山楂黄酮提取率；也高于大果山楂果实的黄酮提取率（22.68 mg/g）（黄欣欣等，2015），说明广西大果山楂叶的黄酮含量较高。因素交互作用分析结果表明，提取温度与料液比的交互作用对广西大果山楂叶黄酮提取率影响显著，提取时间与料液比、提取温度与提取时间的交互作用对黄酮提取率影响不显著，与周海旭等（2011）、黄欣欣等（2015）的研究结果不完全一致，可能与采用的试验方法不同有关。

4 结论

响应面优化得到的超声波辅助水提存在一定差异广西大果山楂叶黄酮工艺具有提取率高、精度高、工艺稳定的优点，可在生产中推广应用。

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（責任编辑 罗 丽）