吴孝波,冯 慧，黄 强,刘勇强,姬红丽,杨 芳,刘育生,彭云良*,杨成明

(1.四川省原子能研究院，四川 成都 610101;2.四川省农业科学院植物保护研究所，四川 成都 610066)

水稻是我国重要的粮食作物，提高水稻产量是水稻生产育种的重要课题，受到多种环境胁迫的影响，其中由稻瘟菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病就是危害最大的生物胁迫。稻瘟病的大面积爆发对我国的粮食安全就会造成重大隐患，近年来，两系杂交水稻因产量优势强，且生产成本更低而得到大面积推广。因此提高两系水稻对稻瘟病的抗性一直以来都是水稻抗病育种的重要课题。在生产上，水稻生产的方式也发生了较大的变化，工厂化育苗已形成发展趋势。具有标记性状的杂交水稻的应用，有利于保证田间纯度进而提高产量。

稻瘟病在我国是水稻生产上的最重要的病害之一。2007年，湖北来凤县穗颈瘟的大流行，造成了水稻严重减产，产量损失在20%～80%，严重的颗粒无收，给农民造成了巨大的经济损失[1]。2014年，受极端气候、品种抗性、栽培措施和防控效果等因素影响，稻瘟病在我国局部稻区突发流行，全国发病面积513.6万hm2，造成实际损失55.8万t。尤其在长江中下游稻区，这次稻瘟病发生为近20年来最重、发生面积之大、发生程度之重均为历年罕见[2]。实践证明，选育和种植抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施。利用分子标记辅助选择方法来选择抗稻瘟病材料的报道已较多。官华忠等(2006)报道了通过标记辅助连续回交方法将显性广谱抗稻瘟病基因Pi-9导入到金山B-l中[3]。文绍山等(2012)报道了采用杂交和分子标记辅助选择技术，将水稻广谱高抗稻瘟病基因Pi-9(t)导入杂交水稻恢复系泸恢17，再利用抗稻瘟病基因Pi-9(t)的特异分子标记pB8检测该目的基因，获得68份携有Pi-9(t)基因型的回交株系[4]。裘烨等(2018)报道了通过分子标记技术，利用携带广谱抗稻瘟病基因Pi-kh的Tetep为亲本来改良R1，R2的稻瘟病抗性，得到了在田间鉴定有较高稻瘟病抗性的改良恢复系[5]。因此，选育稻瘟病抗性好的水稻品种就显得尤为重要。

不论两系、三系均存在育性不稳定现象，尤其是两系不育系因其本身的育性受环境条件影响较大，易自交结实而影响制种纯度。由于四川省的特殊生态环境造成两系杂交稻制种风险较大。为了解决适合四川两系杂交稻制种和水稻不育系的育性不稳定的问题，保证生产用种的纯度，将隐性紫叶标记性状导入两用系S，容易在苗期进行有效辨识和剔除。为此，为了将紫叶标记性状和Pi-9、Pi-kh基因导入两系材料，我们采用辐射诱变技术、MAS技术和杂交技术相结合的方法，期望获得具有持久稻瘟病抗性的带紫叶标记性状的水稻两用系S材料，以选育出能在四川制种的两系抗病杂交水稻新品种。

1 材料与方法

1.1 材料

亲本材料川香29B、II-32B、P88S、C815S和参考材料广占63S、内香2B由四川省原子能研究院提供；IR22(IRBL9)、IR8(IRBLkh-K3)由四川省农业科学院植保所提供给；紫S由贵州省农业科学院水稻所提供。

1.2 DNA提取及PCR扩增

采用TPS法提取水稻叶片总DNA。Pi-Kh检测用引物为K5-F/K5-R,K6-F/K7-R,K8-F/K8-R。Pi-9位点检测用引物为NBS/PIR。PCR反应体系为25μl，1μl模板DNA，各引物0.5μl(10 mmol·L-1)，12.5μl 2×Taq Mix酶，ddH2O补足25μl。PCR反应程序为：①94℃ 预变性5min。②94℃变性40s。③55℃(NBS/PIR，K8-F/K8-R)，57℃(K5-F/K5-R，K6-F/K7-R)退火1min。④72℃延伸1.5min；重复②～④共35个循环。⑤72℃聚合10min。⑥12℃保温。扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上鉴定。

1.3 PCR产物测序及分析

采用sanger测序法，由成都擎科梓熙生物技术有限公司3730xl DNA Analyzer测序仪上完成，测序结果使用软件MEGA7分析，选择Neighbor-Joining法。

图1 5500S和5514S的选育示意图

在四川省农科院植保所稻瘟病病圃进行田间抗性鉴定，并将其中选择的优系同时进行室内检测抗病基因，其中5500S和5514S田间抗性和综合农艺性状表现很好。

2 结果与分析

2.1 两用系5500S和5514S的选育

用含抗稻瘟病基因Pi-9和Pi-kh的单基因系IR22、IR8分别与P88S配制杂交F1代，二者再杂交形成F1代，并用480Gy剂量、72Gy/h剂量率的γ射线辐照杂交种子(种子水分12.0%)得到M1F1代，并用M1F1代与C815S杂交形成F1代，并在四川、海南连续加代得到F4代；用P88S和川香29B杂交的F6代与紫S杂交得到F1代种子，并用剂量480Gy、剂量率72Gy/h的γ射线辐照F1代种子(种子水分12.0%)，在四川、海南连续加代得到M4F5代；二者再杂交得到F1代，经过连续加代，在F5代将这两个S材料在四川省农科院植保所邛崃抗病鉴定基地进行田间自然诱发鉴定，同时委托四川省农科院植保所进行室内抗稻瘟病基因检测，最后得到两用系S新材料5500S和5514S。其选育过程见图1。

2.2 特征特性

5500S，开花习性好，柱头外露率高，柱头双露率达75%左右。在四川绵竹播抽期85d左右，株高84cm左右，茎秆粗壮，抗倒力强。叶片紫色，分蘖力强，平均每穗颖花数183个左右。

5514S，开花习性好，柱头外露率高，柱头双露率达72%左右。在四川绵竹播抽期85d左右，株高83cm左右，茎秆粗壮，抗倒力强。叶片紫色，分蘖力中等，平均每穗颖花数195个左右。

2.3 田间抗性鉴定

经由四川省农科院植保所在其邛崃基地进行稻瘟病抗性鉴定。按照田间自然诱发稻瘟病调查方法、病情分级和记载标准进行，结果为：5500S和5514S两个材料的叶瘟为4～5 级，穗颈瘟为3～5级，而对照F优498的叶瘟和穗颈瘟均为9 级(表1)，说明这2个两用不育系水稻新材料都具有很好的抗性。

表1 5500S和5514S及F优498在邛崃的稻瘟病鉴定(2017)

2.4 抗性基因检测

由图2～5可以得出，5500S、5514S含有Pi-Kh基因和Pi-9位点的一个新等位基因，其中Pi-Kh基因与IRBL kh-K3、C815S有关，而Pi-9等位基因则来自于P88S。

图2 不育系5500S和5514S中Pi-9基因扩增产物电泳图

条带1：川香29B，条带2:II-32B，条带3:P88S，条带4:广占63S，条带5：内香2B，条带6：C815S，条带7～11：5500S，条带12～16：5514S，条带17： IRBL9，条带18：M2-9-14UL，条带19：Co39，条带20：LTH，条带21：ddH2O；其中川香29B 、II-32B 、P88S 、C815S为亲本，IRBL9为正对照，M2-9-14UL为负对照，CO39和LTH为感病对照。引物NBSF/PIR，PCR产物大小约2.9kb。

图3 利用Pi-9等位基因和检测样品测序结果系统发育树

图4 不育系5500S和5514S中Pi-Kh基因扩增产物电泳图

条带1：川香29B，条带2：II-32B，条带3：P88S，条带4：广占63S，条带5：内香2B，条带6：C815S，条带7～11：5500S，条带12～16：5514S，条带17：IRBLkh-K3，条带18：M2-9-14UL，条带19：CO39，条带20：LTH，条带21：ddH2O；其中川香29B、II-32B、P88S、C815S为亲本，IRBLkh-K3为正对照，M2-9-14UL为负对照，CO39和LTH为感病对照，LTH含Pi-Kh基因，但因位点突变，不表现抗病性。引物K5-F/K5-R，PCR产物大小约1.7kb，引物K6-F/K7-R，PCR产物大小约2.3kb。

图5 Pi-Kh等位基因和检测样品测序结果系统发育树

3 结论

通过辐射诱变技术、MAS技术与杂交技术创制出的带紫叶标记性状的水稻材料5500S和5514S，开花习性好，柱头外露率高，茎秆粗壮，抗倒力强，田间诱发稻瘟病抗性表现颈瘟3-5级。这2个材料中，含有Pi-Kh基因和Pi-9位点的一个新等位基因。这可以为今后培育两系杂交水稻抗病品种打下基础。这2个带隐性紫叶标记性状的、含Pi-Kh和Pi-9抗稻瘟病基因的两用系的成功创制，不仅可以简单而有效地保证水稻大田生产纯度进而提高质量，同时也可以为选育新的抗病两系杂交水稻新组合提供重要的亲本来源。