杨芳芳，高玉海，葸慧荣，李文苑，马慧萍，陈克明

兰州总医院 1骨科研究所 2药剂科，兰州 730050

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨的微观结构退化为特征，并表现为骨的脆性增加及易于发生骨折的全身性骨骼疾病[1]。随着我国人口结构日趋老龄化，骨质疏松症的发生率逐年上升，对老年人生活质量和身体健康已构成严重威胁。目前临床治疗骨质疏松症以西药为主，其具有一定疗效，但都有较大的不良反应，如降钙素在临床上有恶心呕吐、食欲减退、头晕乏力、面红发热的不良反应[2]；若停用双膦酸盐会导致骨降解率上升及骨量逐步丢失[3]。中药治疗具有不良反应小、价格便宜的特点。因此，探索有效中药预防与治疗骨质疏松症有重要的意义。丹参属于活血化瘀药，有祛瘀止痛、活血通经的功能，并有研究表明能提高体外培养大鼠骨髓间充质干细胞增殖速率，对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化有明确的诱导作用[4]。白藜芦醇是一种天然的植物雌激素，类似于机体产生的甾体激素，其在骨正常生长环境下，对骨生长具有明显的促进作用，对失重、疾病等状态下的骨具有保护作用[5]。有动物实验表明，中药联合雌激素能缓解模型大鼠的骨质疏松表现[6]。因此，本研究将丹参酮ⅡA和白藜芦醇联合，研究此复方药物对大鼠峰值骨密度和骨质量的影响，并对其预防骨质疏松活性做出初步判断，为开发抗骨质疏松中药复方奠定基础。

材料和方法

试剂与仪器丹参酮ⅡA(陕西宝鸡辰光生物科技有限公司，批号：20150816)；白藜芦醇(陕西宝鸡辰光生物科技有限公司，批号：20160916)；10%水合氯醛(天津市光复精细化工研究所)；双能X射线骨密度仪(Lunar Prodigy，GE 公司，美国)；AG-IS 万能材料试验机(岛津公司，日本)；骨形成指标骨钙素检测试剂盒和骨吸收指标TRAP5b检测试剂盒(Rat-MIDTM Osteocalcin EIA和Rat TRAPTMELISA，IDS公司，丹麦)；SP1600硬组织切片机(LEICA公司，德国)；正置荧光显微镜(BX51，Olympus，日本)；酶标仪(Epoch，BioTek公司，美国)。

实验动物1月龄Wistar雌性大鼠40只，无特定病原体动物，体重(97±3)g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供[合格证号：SCXK (甘)2011- 0001]；大鼠饲养于洁净动物房，自由饮水(自来水)和进食。

分组和给药实验大鼠使用随机数字表法分为4组，每组10只，分为丹参酮ⅡA组、白藜芦醇组、丹参酮ⅡA与白藜芦醇复方组和正常对照组。丹参酮ⅡA按每只大鼠 22 mg/(kg·d)给药，白藜芦醇按16.8 mg/(kg·d)，复方药中丹参酮ⅡA按11 mg/(kg·d)、白藜芦醇按8.4 mg/(kg·d)给药，均用蒸馏水配成溶液，正常对照组灌服相同体积蒸馏水。

骨密度的测定每月检测1次全身骨密度，检测前先腹腔注射4%水合氯醛(0.3 ml/kg)麻醉，待检测到用药组与对照组间差异有统计学意义后即处死所有实验动物，剥离椎骨、双侧股骨和胫骨，测定椎骨和左侧股骨的骨密度。

股骨三点弯曲实验将右侧股骨从4%多聚甲醛中取出，剔除附着的组织，进行三点弯曲实验。跨距为13 mm，速度为10 mm/min。记录载荷变形曲线，得到最大载荷和弹性模量等指标。

椎骨压缩实验将椎骨从4%多聚甲醛中取出，剪取大鼠L4椎，除去附着的组织，将椎体上下两面磨平，置于钢制平台上，进行压缩实验，加载速度为2 mm/min，过最大载荷后停止加载，记录载荷变形曲线，得出最大载荷和弹性模量等指标。

骨形态计量分析将右侧胫骨用4%多聚甲醛彻底固定后，依次脱水、包埋、切片，再用1200、1500、2000目的砂纸均匀打磨至半透明，用品红-苦味酸进行染色。镜下观察骨组织形态结构，用IPP 6.0软件分析骨小梁相关参数。

血清骨代谢生化指标分析大鼠临处死前用10%水合氯醛麻醉，腹腔动脉取血，以3000 r/min离心10 min，离心半径为95 mm，取上清液，分装后置于-80℃冰箱保存。按酶联免疫吸附法试剂盒说明书步骤测定血清中抗酒石酸酸性磷酸酶和骨钙素含量，绘制标准曲线，测定405 nm和450 nm处吸光值，计算含量。

统计学处理采用SPSS 17.0分析软件进行分析，数据用均数±标准差表示，不同组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较用LSD检验法。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

体重4组大鼠的体重在实验期间差异无统计学意义(P>0.05)，与对照组相比，8周后复方组大鼠体重有增加的趋势，但差异无统计学意义(P=0.203)(表1)。

骨密度1个月后4 组大鼠全身骨密度差异无统计学意义。丹参酮ⅡA组(P=0.009)和复方组全身骨密度(P=0.016)较对照组均上升，而白藜芦醇组与对照组比较差异无统计学意义(P=0.178)(表2)。复方组离体股骨骨密度(P=0.001)和离体椎骨骨密度(P=0.034)显著高于对照组，丹参酮ⅡA组股骨骨密度显著高于对照组(P=0.029)，而离体椎骨骨密度与对照组比较差异无统计学意义，白藜芦醇组的离体椎骨和股骨骨密度与对照组比较差异均无统计学意义(表3)。

骨生物力学股骨三点弯曲实验显示，复方组(P=0.038)和丹参酮ⅡA组(P=0.011)股骨的最大载荷均显著高于对照组(表4)，复方组股骨弹性模量值(P=0.044)与对照组比较差异有统计学意义，白藜芦醇组的最大载荷和弹性模量与对照组比较差异均无统计学意义。大鼠椎骨压缩实验结果显示，复方药最大载荷值(P=0.010)和弹性模量(P=0.040)显著高于对照组，而丹参酮ⅡA组和白藜芦醇组与对照组比较差异无统计学意义(表5)。

表 1 4组大鼠不同时间体重测定结果 (n=10，-±s，g)Table 1 Body weight of rats at different time points in four groups (n=10，-±s，g)

P1：丹参酮ⅡA组与对照组比较；P2：白藜芦醇组与对照组比较；P3：复方药物组与对照组比较

P1：tanshinone Ⅱ A group was compared with control group；P2：resveratrol group was compared with control group；P3：compound drug group was compared with control group

表 2 4组大鼠不同时间全身骨密度测定结果(n=10，-±s，g/cm2) Table 2 Whole-body bone mineral density at different time points in four groups (n=10，-±s，g/cm2)

P1：丹参酮ⅡA组与对照组比较；P2：白藜芦醇组与对照组比较；P3：复方药物组与对照组比较

P1：tanshinone Ⅱ A group was compared with control group；P2：resveratrol group was compared with control group；P3：compound drug group was compared with control group

表 3 4组大鼠离体骨密度测定结果(n=10，-±s，g/cm2) Table 3 Bone density in vitro in four groups (n=10，-±s，g/cm2)

P1：丹参酮ⅡA组与对照组比较；P2：白藜芦醇组与对照组比较；P3：复方药物组与对照组比较

P1：tanshinone Ⅱ A group was compared with control group；P2：resveratrol group was compared with control group；P3：compound drug group was compared with control group

表 4 4组大鼠股骨三点弯曲实验测定结果(n=10，-±s)Table 4 Three-point bending test of femur in four groups (n=10，-±s)

P1：丹参酮ⅡA组与对照组比较；P2：白藜芦醇组与对照组比较；P3：复方药物组与对照组比较

P1：tanshinone Ⅱ A group was compared with control group；P2：resveratrol group was compared with control group；P3：compound drug group was compared with control group

表 5 4组大鼠椎骨压缩实验测定结果(n=10，-±s)Table 5 Results of vertebral compression test of rats in four groups (n=10，-±s)

P1：丹参酮ⅡA组与对照组比较；P2：白藜芦醇组与对照组比较；P3：复方药物组与对照组比较

P1：tanshinone Ⅱ A group was compared with control group；P2：resveratrol group was compared with control group；P3：compound drug group was compared with control group

骨形态计量分析结果骨组织呈红色，骨骺线下红色网状结构为骨小梁，对照组红色结构较药物组稀疏，复方组骨小梁的数量明显多于白藜芦醇单体组和丹参酮ⅡA单体组(图1)。量化分析结果显示，丹参酮ⅡA和复方组的骨小梁数量(P=0.033，P=0.024)、骨小梁宽度(P=0.043，P=0.040)和骨小梁面积百分比(P=0.040，P=0.038)显著高于对照组，而骨小梁分离度(P=0.034，P=0.032)则显著低于对照组，而白藜芦醇组骨小梁宽度和骨小梁面积百分比与对照组比较差异均无统计学意义(表6)。

血清骨代谢水平与对照组相比，丹参酮 ⅡA(P=0.040)和复方药物(P=0.033)能显著提高大鼠血清中骨形成指标骨钙素的含量，同时显著降低血清中抗酒石酸酸性磷酸酶5b的含量，并且复方药物(P=0.043)的作用强于丹参酮ⅡA(P=0.028)，而白藜芦醇组的骨钙素和抗酒石酸酸性磷酸酶5b含量与对照组比较差异均无统计学意义(表7)。

A.对照组；B.白藜芦醇组；C.丹参酮ⅡA组；D.复方组

A. control group；B. resveratrol group；C. tanshinoneⅡA group；D. compound group

图14组大鼠胫骨心干骺端骨组织形态学变化(×40)

Fig1Morphological changes of tibial cardiac metaphyseal bone in four groups (×40)

表 6 4组大鼠胫骨近心干骺端组织计量学静态参数(n=10，-±s)Table 6 Histomorphometric indices in the proximal tibia metaphysis of four groups (n=10，-±s)

P1：丹参酮ⅡA组与对照组比较；P2：白藜芦醇组与对照组比较；P3：复方药物组与对照组比较

P1：tanshinone Ⅱ A group was compared with control group；P2：resveratrol group was compared with control group；P3：compound drug group was compared with control group

表 7 4组大鼠血清骨钙素和抗酒石酸酸性磷酸酶5b的含量 (n=6，-±s)Table 7 The serum levels of osteocalcin and tartrate-resistant acid phosphatase 5b in four groups (n=6，-±s)

P1：丹参酮ⅡA组与对照组比较；P2：白藜芦醇组与对照组比较；P3：复方药物组与对照组比较

P1：tanshinone Ⅱ A group was compared with control group；P2：resveratrol group was compared with control group；P3：compound drug group was compared with control group

讨 论

峰值骨量是骨成熟末期达到的最大骨量，是骨最坚硬、骨矿含量最高的时期[7]。青少年峰值骨量的高低对老年时的骨量至关重要，是决定老年期是否发展为骨质疏松症的重要因素[8]。因此，研究提高峰值骨量的药物对预防骨质疏松症有重要的意义。由于西药具有副作用大、价格昂贵的特点，因此，以中药为主的临床治疗是未来的必然趋势。目前，中药临床治疗主要以中药复方为主，在此领域也有很多探索抗骨质疏松症中药新药的研究，黄莉等[9]通过补肾健脾化瘀方干预去势大鼠，发现其可改善去势大鼠血脂代谢异常状态，并提高骨矿含量和骨密度。刘爽等[10]发现补肾复方可能通过降低骨质疏松症模型大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶的含量，提高骨生物力学性能和改善骨结构退行性改变，达到治疗骨质疏松症的作用。有动物实验表明蛇床子素可有效提高大鼠的峰值骨量[11]。中药有不良反应小、多靶向性和综合性疗效的特点，但同时有肠道吸收率极低的缺点，早期有学者提出吸收与代谢后寡单体复合药物，吸收与代谢后寡单体复合药物的概念基于中药中发挥作用的组分数量有限，在分离、纯化并了解其药理作用的基础上，将纯化后的这些化合物以一定比例重新组合起来，组成一个与原有的中药在理论上具有同等或更佳疗效的新型复合药物[12]。到目前为止，尚未发现关于中药单体复方对峰值骨量活性影响的研究。本研究将分别具有活血和雌激素性的两味中药单体组成复方，探寻其对大鼠峰值骨量的影响。金雀异黄酮是公认的有明确抗骨质疏松症疗效的药物[13]，可参考成魁等[14]研究中用金雀异黄酮的浓度(10 mg/kg)转换成同样摩尔浓度的蛇床子素(与前者为不同物质)的方法换算出丹参酮 ⅡA和白藜芦醇的浓度，分别为11和8.4 mg/kg，为了使单体和复合药中相应单体的浓度一致，丹参酮ⅡA和白藜芦醇浓度分别为22和16.8 mg/kg。

本研究显示，灌服丹参酮ⅡA和白藜芦醇的复方药两个月后，大鼠全身骨密度和离体骨密度均显著增加，同时胫骨近端骨小梁的数量和宽度显著增加，骨小梁分离度却显著减小，表明骨小梁的致密程度明显增加。血清骨代谢指标检测结果表明，大鼠的骨形成指标增加而骨吸收指标下降，表明此复合药可能是通过提高骨形成和抑制骨吸收而影响骨代谢，最终导致骨密度增加，骨质量明显提高。并且数据显示，此复方药对骨质量的提高效果均优于丹参酮ⅡA和白藜芦醇单体，可能是两种单体发生了协同作用，因此可以通过提高峰值骨量而达到预防老年性或绝经后骨质疏松的效果，从而为开发抗骨质疏松中药复方奠定基础，也打破了传统中药复方研究的瓶颈，但是，以用药安全为原则，复方药物在体内的代谢机制以及药物间的相互作用有待进一步研究。