闫 超，张连海，陕 飞，李双喜，贾永宁，李子禹

北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所 胃肠肿瘤中心 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142

微小RNA(microRNA,miR)是一类含有19～25个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA，广泛存在于真核生物中，具有高度保守性。miR通过与靶mRNA的3’非编码区碱基互补结合，促进靶mRNA的降解或抑制其翻译，从而调控靶基因的表达，影响细胞的增殖、分化和凋亡等过程[1]。研究显示，miR由其下游基因介导，参与肿瘤细胞的活动及相邻微环境的变化，在多种肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生发展密切相关。多种miR参与胃癌的发生和进展，如miR- 19a通过激活核因子-κB信号通路促进胃癌细胞的增殖[2]，胃癌中miR- 155的下调促进胃癌恶性表型的形成[3]。miR- 199已被发现在肝癌[4]和头颈部肿瘤[5]中表达失调，但在胃癌中的作用尚不明确。本研究通过检测胃癌组织和胃癌细胞中miR- 199的表达情况，并改变miR- 199的表达，观察其对胃癌细胞恶性表型的影响，并初步探索其作用机制。

材料和方法

材料胃癌组织及配对的癌旁组织取自51例Ⅱ～Ⅲ期的进展期胃癌患者(美国癌症联合委员会第8版胃癌分期系统)。实验细胞系AGS、SGC- 7901、MKN28、MKN- 45、KATO-Ⅲ和GES- 1由北京市肿瘤防治研究所提供。多克隆抗体TBL1XR1购自Proteintech公司;β-actin抗体购自Sigma-Aldrich公司；细胞计数试剂盒和双荧光素酶报告基因试剂盒购自Promega公司；实时 PCR 试剂盒购自Takara公司；脂质体转染试剂LipofectamineTM2000及TRIzol试剂购于美国Life Technologies公司；miR- 199模拟物和抑制剂均购自广州锐博公司，其转染方法参照说明书进行。

细胞培养实验细胞系AGS、SGC- 7901、MKN28、MKN- 45、KATO-Ⅲ和GES- 1的培养条件为90% RPMI 1640 培养基，加10% 胎牛血清，于37℃、5% CO2孵箱中培养。

细胞增殖实验取对数生长期细胞，胰酶消化，收集细胞，加入完全培养基，调整细胞浓度为1×104/ml，接种于96孔板中，每孔100 ul，每孔设5个复孔，培养24、48、72、96 h，每孔加入10%的MTS完全培养基，继续在培养箱孵育1 h，在酶联免疫检测仪上选择490 nm波长，测定各孔的吸光度值。

细胞迁移实验转染24 h后，用无血清的RPMI 1640培养基饥饿细胞12 h，消化的细胞用无血清RPMI 1640培养基洗两遍，以每孔10万个细胞量接种于Costar 24-WellTranswellTM上室，在下室中加入700 μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37℃、5%CO2培养10 h后，用甲醇固定Transwell小室1 min，结晶紫染色5 min，用棉棒擦去小室内底部表面的细胞。每个培养孔随机选择9个视野用正置显微镜(100倍)拍照，计数，计算每组小室细胞的平均数。

双荧光素酶报告系统载体构建及检测从人基因组总DNA中扩增TBL1XR1的3’非翻译区，克隆到报告载体pMIR-REPORT荧光素酶报告基因的下游。同时构建pMIR-REPORT-MUT载体，此载体突变了miR- 199与TBL1XR1结合位点。胃癌细胞MKN45接种在6孔板中，次日进行报告载体和miR- 199模拟物转染，48 h后，使用双荧光素酶系统检测荧光素酶活性。

Westernblot检测蛋白表达按蛋白分子质量要求制备相应浓度的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶和积层胶，取等量蛋白，加入等体积上样缓冲液，变性后上样。湿转1.5 h后，将聚偏二氟乙烯膜放入封闭液中，室温封闭1 h。用封闭液按一定比例稀释一抗，封膜，4℃过夜。用1×PBST室温漂洗3次，每次10 min。二抗，室温孵育1 h。用1×PBST室温漂洗3次，每次10 min。用FUJIFILM仪器进行曝光。

统计学处理采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

miR-199在组织和细胞中的表达51例胃癌患者中位年龄61岁(28～77岁)，其中男性37例、女性14例，Ⅱ期22例、Ⅲ期29例，高-中分化胃癌25例、低分化胃癌26例。采用实时PCR法，在51例胃癌组织和配对的癌旁组织中检测miR- 199的表达。结果显示，肿瘤组织miR- 199的表达显著低于癌旁组织(0.2635±0.0303比1.6700±0.9613，t=13.95，P<0.001)，与胃癌的分化程度(P=0.036)和分期(P=0.017)相关，与患者的年龄和性别无关；细胞实验结果显示，miR- 199在胃癌细胞系AGS(t=9.13，P<0.001)、 SGC- 7901(t=8.88，P<0.001)、 MKN28(t=10.80，P<0.001)、KATO-Ⅲ(t=10.31，P<0.001)和MKN- 45(t=13.10，P<0.001)中的相对表达量显著低于正常胃黏膜上皮细胞GES- 1，差异有统计学意义(图1)。

干扰胃癌细胞中miR-199的表达后，细胞增殖能力的改变分别采用miR- 199模拟物作用于MKN- 45细胞株、miR- 199抑制剂作用于KATO-Ⅲ细胞株，采用MTS法检测细胞的增殖能力。采用miR- 199模拟物作用24 h(t=13.96，P<0.001)、48 h(t=17.07，P<0.001)、72 h(t=30.36，P<0.001)、96 h(t=18.41，P<0.001)后，细胞增殖能力较对照组显著降低；采用miR- 199抑制剂作用48 h(t=14.97，P<0.001)、72 h(t=32.45，P<0.001)、96 h(t=52.86，P<0.001)后，细胞的增殖能力较对照组显著提高(图2)。

miR：微小RNA

miR：microRNA

图1miR- 199在组织(A)和细胞系(B)中的表达情况

Fig1Expressions of miR- 199 in gastric carcinoma tissue (A) and cell lines (B)

1：MKN45 + miR对照组；2: MKN45 + miR- 199模拟物组；3: KATO-Ⅲ + miR对照组；4: KATO-Ⅲ + miR- 199抑制剂组

1: MKN45 + miR control；2: MKN45 + miR- 199 mimic；3: KATO-Ⅲ + miR control；4: KATO-Ⅲ + miR- 199 inhibitor

A. 在MKN45中过表达miR- 199后，细胞增殖能力下降；B. 在KATO-Ⅲ中敲降miR- 199后，细胞增殖能力增强

A. cell proliferation declined after the over-expression of miR- 199 in MKN45；B. cell proliferation increased after the knockdown miR- 199 in KATO-Ⅲ

图2miR- 199的表达与细胞增殖能力的关系

Fig2Relationship between the expression of miR- 199 and the cell proliferation ability

干扰miR-199在胃癌细胞中的表达后，细胞迁移能力的改变为进一步研究miR- 199在胃癌中的功能，采用细胞迁移实验检测胃癌细胞迁移能力的改变。结果显示miR- 199模拟物作用于MKN- 45细胞后，细胞的迁移能力较对照组减弱(t=24.90，P<0.001)。miR- 199抑制剂作用于KATO-Ⅲ细胞后，细胞的迁移能力较对照组增强(t=32.59，P<0.001)(图3)。

miR-199与TBL1XR1基因的关系使用Targetscan软件预测TBL1XR1是miR- 199的靶调控基因，可以和TBL1XR1基因序列4378～4384位点(CACUGG)反向互补结合。将海肾荧光质粒分别与含有TBL1XR13’UTR和TBL1XR13’UTRMUT的pMIR-REPORT质粒转染MKN45细胞。双荧光报告结果显示，与miR- 199对照组比较，miR- 199模拟物可以抑制带有TBL1XR13’UTR序列质粒的荧光，使荧光值下降(3.092±0.1022比1.766±0.0132，t=91.55，P<0.001)；而miR- 199模拟物不能抑制带有突变位点TBL1XR13’UTRMUT序列质粒的荧光，荧光值为2.989±0.045和3.194±0.0258(t=0.08，P=0.942)。

miR-199对TBL1XR1基因表达的影响将miR- 199模拟物与miR- 199对照分别转染至SGC7901和MKN28细胞，细胞培养72 h后收集蛋白，Western blot检测TBL1XR1蛋白表达。结果显示高表达miR- 199组的细胞TBL1XR1蛋白表达水平较对照组显著降低(图4)。

1：MKN45 + miR对照组；2: MKN45 + miR- 199模拟物组；3: KATO-Ⅲ + miR对照组；4: KATO-Ⅲ + miR- 199抑制剂组

1: MKN45 + miR control；2: MKN45 + miR- 199 mimic；3: KATO-Ⅲ + miR control；4: KATO-Ⅲ + miR- 199 inhibitor

A. 在MKN45中过表达miR- 199后，细胞迁移能力下降(×100)； B. 在KATO-Ⅲ中敲降miR- 199后，细胞迁移能力增强(×100)

A. cell migration declined after the over-expression of miR- 199 in MKN45 (×100); B. cell migration increased after the knockdown miR- 199 in KATO-Ⅲ(×100)

图3miR- 199的表达与细胞迁移能力的关系

Fig3Relationship between the expression of miR- 199 and the cell migration ability

1: SGC7901 + miR对照组; 2: SGC7901 + miR- 199模拟物组；3: MKN28 +miR对照组; 4: MKN28 + miR- 199模拟物组

1: SGC7901 + miR control；2: SGC7901 + miR- 199 mimic；3: MKN28 + miR control；4: MKN28 + miR- 199 mimic

图4过表达miR- 199对TBL1XR1表达的影响

Fig4Effect of over-expression of miR- 199 on the expression of TBL1XR1

讨 论

随着研究的深入，miR的作用逐渐被认识和肯定。miR在多种肿瘤中呈异常表达，参与肿瘤细胞的活动及相邻微环境的变化，在肿瘤的发生发展、浸润转移等过程中发挥重要的作用。miR的靶基因决定了其在人体内发挥癌基因或是抑癌基因的作用，每一条miR可能对数百个基因发挥调节作用，miR的表达及功能也受到多种因素的调节，如基因序列、磷酸化水平、酶的修饰等。许多miR通过不同的机制参与胃癌的发生发展。例如，miR- 106- 25b家族的miR- 25、miR- 106及miR- 93b在胃癌组织及细胞系中呈明显的高表达，可能参与了胃癌的发生过程[6]。miR- 650的过表达通过影响肿瘤生长抑制因子4促进胃癌的发生发展及细胞增殖[7]，降低miR- 27的表达可抑制胃癌细胞的增殖[8]。miR- 9在胃癌组织中的表达明显升高，而在配对的癌旁正常组织中呈低表达，可促进胃癌细胞增殖、侵袭和迁移[9]。以上miR在胃癌中发挥癌基因的作用，也有一些miR发挥抑癌基因的作用。miR- 34a的靶基因是癌基因PDGFR，miR- 34a通过抑制PDGFR基因抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移[10]。另外，miR- 21在合并淋巴结转移的胃癌组织中的表达水平显著高于无淋巴结转移的胃癌组织[11]，表明miR的表达水平可能与胃癌的淋巴结转移有关。

miR- 199在多种恶性肿瘤中发挥抑癌基因的作用。在结肠癌中，miR- 199通过调节GCNT2影响结肠癌细胞的上皮-间质转化[12]。miR- 199在肝细胞肝癌中通过抑制G蛋白信号调节因子抑制肝细胞肝癌的增殖、侵袭和迁移[13]。miR- 199家族成员在膀胱癌中通过作用于整合素α3抑制肿瘤细胞，其高表达可能作为膀胱癌预后较好的预测指标[14]。由此可见，miR- 199在不同的恶性肿瘤中发挥近似的抑癌作用，并可能与预后相关。本研究结果显示，miR- 199在胃癌组织中的表达较配对的癌旁正常组织低，上调胃癌细胞中miR- 199的表达可抑制细胞的增殖和迁移。miR通过调控靶基因3’非翻译区发挥作用，本研究预测和验证了TBL1XR1是miR- 199的靶基因。TBL1XR1在肿瘤中发挥癌基因的作用，例如高表达的TBL1XR1与食管鳞癌的淋巴结转移密切相关[15]。miR- 199可以作用于TBL1XR1的3’非翻译区，影响其表达，发挥抑癌作用，该结论提供了新的TBL1XR1调控机制，进一步深化了对miR- 199功能的研究。通过抑制TBL1XR1，miR- 199在胃癌中发挥抑癌基因的作用，与在其他肿瘤中得到的结论一致。

综上，miR参与了胃癌的发生发展过程，其表达水平与胃癌的生物学行为及预后相关。miR- 199在胃癌中具有显著的表达差异，未来将可能作为标志物应用于胃癌的辅助诊断和疗效评价。笔者将对miR- 199进行进一步的研究，探索miR- 199作为胃癌标志物的前景，为胃癌的临床诊疗提供新的思路。