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沉默FSTL1减少衣霉素诱导软骨细胞内质网应激及细胞凋亡

2018-09-05王美美徐晓龑刘璘琛

基础医学与临床 2018年9期
关键词:内质网霉素克隆

杨 蓉,王美美*,杨 杨,许 晋,徐晓龑,施 青,刘璘琛

(1.东南大学附属中大医院 风湿免疫科, 江苏 南京 210009;2.南京医科大学第一附属医院 心内科, 江苏 南京 210009)

骨关节炎(osteoarthritis,OA)作为常见的关节疾病,以关节软骨退行性改变及继发性骨质增生为主要表现,可导致关节软骨损伤,甚至累及整个关节,严重影响患者生存质量[1]。OA发生机制较为复杂,目前尚未完全清楚。软骨细胞作为成熟关节软骨中维持正常生理功能最为重要的细胞,其异常凋亡在OA发病中发挥重要作用[2]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在调控软骨细胞凋亡过程中发挥关键性作用[3]。衣霉素处理软骨细胞是构建OA发病细胞模型的重要方法[4],主要通过ERS而介导软骨细胞凋亡。卵泡抑素样蛋白1(follistatin-like protein 1,FSTL1)作为分泌性胞外糖蛋白,广泛存在于人体组织,在细胞增殖、分化、凋亡、免疫及炎性反应等多种生理功能中发挥重要作用[5]。本研究拟利用小分子RNA干扰技术特异性沉默FSTL1基因,观察其对衣霉素诱导软骨细胞ERS及细胞凋亡的影响,以及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂:衣霉素(Sigma-Aldrich公司),用无水乙醇制备衣霉素溶液,实验前用含0.5% FBS培养液配制浓度2 μg/mL;DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、Lipofectamine转染试剂盒和Trizol总RNA提取试剂盒(Invitrogen公司);反转录试剂盒和PCR试剂盒(TaKaRa公司);siRNA-FSTL1和siRNA-NC序列(上海吉玛制药技术有限公司设计、合成和鉴定);FSTL1、Bcl- 2、Bax及内参基因引物(上海生工生物公司设计合成);MTT法细胞增殖检测试剂盒(上海哈灵生物试剂检测中心);Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司);兔抗大鼠蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)多克隆抗体、兔抗人葡萄糖调节蛋白78(GRP78)多克隆抗体、兔抗鼠活化转录因子4(ATF4)多克隆抗体和兔抗大鼠C/EBP同源蛋白(CHOP)多克隆抗体(Santa Cruz公司);兔抗大鼠钙网蛋白(Cal)多克隆抗体(Abcam公司);兔抗大鼠p-PERK、eIF2α和p-eIF2α多克隆抗体(CST公司)。

1.1.2 动物:普通级新西兰兔,雄性,6周龄,体质量1.2~1.3 kg[南京金陵种兔场,生产许可证:SCXK(苏)2012- 0003]。

1.2 方法

1.2.1 兔软骨细胞分离、培养及分组处理:取兔膝关节软骨,切成1 mm3大小组织块,0.25%胰蛋白酶消化60 min,用0.20% Ⅱ型胶原酶消化4~6 h,离心后,获得软骨细胞。将细胞置于含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,制备细胞悬液,调整细胞为2×105个/mL,接种于培养板中,待细胞汇合度达85%~90%时,将细胞分为:1)空白对照组:不加入任何处理;2)衣霉素组:加入2 μg/mL衣霉素溶液;3)衣霉素+siRNA-FSTL1组:加入2 μg/mL衣霉素溶液同时,利用Lipofectamine转染试剂盒转染siRNA-FSTL1序列:5′-UGCAAAUACUUACGGACU UUU-3′;4)衣霉素+siRNA-NC组:加入2 μg/mL衣霉素溶液同时,用Lipofectamine转染试剂盒转染siRNA-NC序列5′-GCAUCUUGAGAUUUAAUCA-3′。培养48 h后对各处理组进行相关实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖:取各处理组细胞,胰蛋白酶消化后,调整细胞为2×103个/孔,接种于96孔板,待细胞贴壁后,分别于24、48、72和96 h时,加入20 μL MMT(5 mg/mL)溶液,继续孵育4 h,弃去上清,将DMSO 150 μL加入各孔,振荡15 min,待结晶物溶解完全。全自动酶标仪取490 nm波长处对各孔吸光度(A)值进行检测。

1.2.3 流式细胞计量术检测细胞凋亡:取各处理组培养48 h后细胞,胰蛋白酶消化后,离心留取细胞沉淀,重悬后,调整细胞为1×106个/mL,接种于6孔板,过夜后无血清处理12 h,向各组分别加入相应的培养液,24 h后收集细胞,预冷PBS洗涤3次,将预冷乙醇4 ℃下固定5 h,离心留取细胞沉淀,PBS洗涤3次,用结合缓冲液500 μL重悬细胞,将Annexin V-FITC 5 μL加入后,再加入PI 5 μL,避光反应20 min,于60 min内利用流式细胞仪对样品进行检测。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测细胞中FSTL1、Bcl- 2和BaxmRNA含量:取各处理组培养48 h后细胞,加入细胞裂解液进行裂解后,用Trizol总RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA,用紫外分光光度计检测总RNA的纯度,取A260/A280≥2.80样品完成后续实验。用反转录试剂盒获得模板单链cDNA,以cDNA为模板进行PCR。FSTL1引物:上游为5′-CCTGTG TGTGGCAGTAATGG-3′,下游为5′-TCAGGAGGGTT GAAAGATGG-3′;Bcl- 2引物:上游为5′-CACAAGA GGCCAAGGCTACCT-3′,下游为5′-CAGGAAAGCAG GAAGTCTCAA-3′;Bax引物:上游为5′-ATTGAGA AACGATTTGCCTACA-3′,下游为5′-GGGAAATGG CTTATTCTCCTTTGCTT-3′;β-actin引物:上游为5′-CCTCATGAAGATCCTGACCG-3′,下游为5′-ACCG CTCATTGCCGATAGTG-3′。PCR反应条件:95 ℃ 1 min,92 ℃ 30 s,92 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,75 ℃ 30 s,连续进行38个循环,每个样品均设置6个平行反应复孔。用2-△△Ct法对各处理组细胞中FSTL1、Bcl- 2及Bax基因相对表达量进行分析。

1.2.5 Western blot检测各处理组细胞中PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白表达:取各处理组培养48 h后细胞,加入细胞裂解液进行裂解,利用总蛋白提取试剂盒对总蛋白进行提取,用BCA蛋白检测试剂盒对总蛋白纯度进行检测。取25 μg总蛋白,进行SDS-PAGE分离,电转移至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉室温下封闭60 min,分别将加入一抗兔抗大鼠PERK、CHOP、Cal、p-PERK、eIF2α或p-eIF2α多克隆抗体、兔抗人GRP78多克隆抗体、兔抗鼠ATF4多克隆抗体(稀释比例分别为:1∶500、1∶1 200、1∶600、1∶800、1∶1 000、1∶800、1∶200、1∶2 000),4 ℃下过夜孵育,用TBST洗膜3次,将二抗加入,孵育90 min,用化学发光试剂盒避光反应30 min,拍照,利用Image J图像分析软件对PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白相对表达量进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各处理组细胞增殖情况比较

与对照组相比,衣霉素组、衣霉素+siRNA-NC组和衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞增殖能力被明显抑制(P<0.05),与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比,衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞增殖能力显著提高(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with tunicamycin group; △P<0.05 compared with tunicamycin+siRNA-NC group图1 MTT法检测各处理组细胞的增殖Fig 1 Cell proliferation in each treatment group was detected by using MTT assay

2.2 各处理组细胞凋亡情况比较

对照组、衣霉素组、衣霉素+siRNA-NC组和衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞凋亡率分别为6.3%±2.8%、27.4%±4.6%、25.5%±3.9%和15.2%±3.7%(P<0.001);两两比较,与对照组相比,衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组细胞凋亡率均升高,与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比,衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞凋亡率降低(P<0.05)(图2)。

2.3 各处理组细胞中FSTL1、Bcl- 2和Bax基因表达的比较

与空白对照组相比,衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组细胞中FSTL1和BaxmRNA相对表达量均升高,而Bcl- 2 mRNA相对表达量均降低(P<0.05);与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比,衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞中FSTL1和BaxmRNA相对表达量均降低,而Bcl- 2 mRNA相对表达量均升高(P<0.05)(表1)。

A.control group;B.tunicamycin group;C.tunicamycin+siRNA-NC group;D.tunicamycin+siRNA-FSTL1 group图2 流式细胞计量术检测各处理组细胞凋亡情况Fig 2 Cell apoptosis in each treatment group was detected by using flow cytometry

groupFSTL1 mRNABcl-2 mRNABax mRNAcontrol group1.17±0.111.73±0.121.22±0.07tunicamycin group1.95±0.16*1.24±0.08*1.86±0.13*tunicamycin+siRNA-NC group1.97±0.18*1.25±0.07*1.89±0.15*tunicamycin+siRNA-FSTL1 group1.56±0.13*#△1.43±0.10*#△1.51±0.11*#△

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with tunicamycin group;△P<0.05 compared with tunicamycin+siRNA-NC group.

2.4 各处理组细胞中PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白表达比较

与空白对照组相比,衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组细胞中PERK、eIF2α蛋白相对表达量均降低,而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白相对表达量均升高(P<0.05),与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比,衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞中PERK和eIF2α蛋白相对表达量均升高,而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白相对表达量均降低(P<0.05)(表2,图3)。

3 讨论

软骨细胞作为成熟软骨中唯一存在的细胞类型,在维持关节软骨正常功能及损伤修复中发挥至关重要的作用,然而,由于关节软骨中缺少血管及神经,软骨细胞只能靠渗透作用而维持正常代谢,因而对各种刺激较为敏感,易发生损伤及凋亡[6]。ERS作为早期细胞抵御外界有害刺激的适应性反应, 一旦持续则可导致细胞凋亡发生[7]。衣霉素作为天然核苷抗生素,可导致内质网中钙离子紊乱及未折叠蛋白蓄积而导致ERS[8]。本研究显示,衣霉素组软骨细胞增殖被抑制,而细胞凋亡率增加、凋亡相关基因表达异常,说明衣霉素可促进软骨细胞凋亡发生。

表2 各处理组细胞中PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白表达比较

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with tunicamycin group;△P<0.05 compared with tunicamycin+siRNA-NC group.

图3 Western blot检测各处理组细胞中蛋白表达Fig 3 Expressions of proteins in each treated group were detected by using Western blot

PERK作为存在于内质网的一种膜蛋白,是介导ERS过程的重要信号通路[9]。细胞发生ERS时,PERK与GRP78解离,被磷酸化而激活,通过促使下游的eIF2α磷酸化而减少蛋白合成,减轻内质网负担,但当应激较严重或持续时间较长时,磷酸化的PERK则通过eIF2α促使ATF4大量表达,而ATF4又可促使CHOP大量表达而促使细胞凋亡[10]。本研究显示,与对照组相比,衣霉素组细胞中PERK、eIF2α蛋白相对表达量均降低,而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白表达量均升高,说明衣霉素通过使软骨细胞内钙超载而激活PERK信号通路,促使ERS发生及细胞凋亡。

FSTL1作为存在于细胞外的基质糖蛋白,参与了炎性反应及免疫功能调节,与自身免疫性疾病关系密切[11]。本研究显示,衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞中FSTL1表达量显著降低。提示,软骨细胞中FSTL1被成功抑制。本研究显示,与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比,衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞增殖显著提高,细胞凋亡率降低,凋亡促进基因Bax被抑制,而凋亡抑制基因Bcl- 2则表达增加。说明特异性抑制FSTL1表达,可有效抑制衣霉素导致的软骨细胞细胞凋亡。而相比与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组,衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞中PERK和eIF2α蛋白表达量升高,而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白表达量降低,说明特异性抑制细胞中FSTL1表达,可有效抑制PERK信号通路,从而减少ERS发生。

综上所述,特异性沉默软骨细胞中FSTL1表达可有效减少ERS及细胞凋亡,其机制可能与抑制PERK信号通路有关。

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