朱 伟，郑世霞，柯琳秋，汪 毅，陈琼科，夏道涵，王红漫

(重庆市人民医院 内分泌/中西医结合科，重庆 400014)

分泌型卷曲相关蛋白5(secreted frizzled related protein 5，SFRP5)是存在于成熟脂肪细胞中的一种细胞激素，可参与非经典的Wnt信号代谢通路[1]。目前对SFRP5的研究主要集中在炎性反应与肥胖，而其对肥胖和糖代谢的影响还存在争议。在多种肥胖动物模型中，SFRP5 mRNA和蛋白水平表达降低，并且给予SFRP5敲除鼠高卡路里饮食会导致其产生严重的葡萄糖耐量受损和肝脏脂肪变性[1]，也有研究指出在肥胖状态下，SFRP5的mRNA表达水平上升[2- 4]；而在临床研究中也是众说纷纭，有研究报道其血清蛋白水平在肥胖和瘦的人类受试者无差异[3]，亦有报道显示在肥胖和2型糖尿病人群中，血浆SFRP5水平呈下降趋势[5]。因此，SFRP5在2型糖尿病发生发展中的作用有待探索验证。

为了探讨SFRP5在糖代谢和胰岛素抵抗中的相关作用机制，本研究在细胞层面对SFRP5进行病毒感染，上调或下调SFRP5表达，干预成功后对细胞葡萄糖摄取、糖异生途径和胰岛素信号通路水平进行研究，旨在为SFRP5在糖代谢中可能的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SFRP5过表达病毒(Ad-SFRP5)和SFRP5抑制病毒(Ad-shSFRP5)(重庆茂晶科技有限公司)；小鼠肝癌细胞系Hepa1- 6(本实验室保存)；DMEM培养基和胎牛血清(Gibco公司)；二甲亚砜(DMSO)(Sigma Aldrich公司)；人工合成胰岛素(诺和灵)(诺和诺德制药有限公司)；葡萄糖测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；RNA抽提试剂Trizol、反转录试剂盒和Syber Green(TaKaRa公司)；细胞蛋白裂解液RIPA和BCA蛋白测定试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；蛋白marker(Thermo Fisher公司)；β-actin抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；鼠抗SFRP5和兔抗PEPCK(Santa Cruz公司)；兔抗G6Pase(Abcam公司)；兔抗p-InsR、兔抗t-InsR、兔抗p-AKT和兔抗t-AKT(CST公司)；山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG(杭州联科生物技术有限公司)；化学发光试剂ECL(Milipore公司)；SFRP5、PEPCK、G6Pase和β-actin引物均合成于(Invitrogen公司)。引物序列为：SFRP5：上游引物：5′-TCTTCCTCTGCTCGCTC TTC-3′，下游引物：5′-GGGCTCCAATCAACTTTCG-3′；PEPCK：上游引物：5′-GCATAACGGTCTGGACTTCT-3′，下游引物：5′-TGATGACTGTCTTGCTTTCG-3′；G6Pase：上游引物：5′-AATCTCCTCTGGGTGGC-3′，下游引物：5′-GCTGTAGTAGTCGGTGTCC-3′；β-actin：上游引物：5′-CCCATCTACGAGGGCTAT-3′，下游引物：5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：在37℃水浴复苏冻存的Hepa1- 6细胞，按常规贴壁细胞培养方法进行培养。将对数期增殖的细胞接种到6孔板中培养，贴壁后分为对照组(Ad-GFP)和实验组：SFRP5过表达组(Ad-SFRP5)和SFRP5抑制组(Ad-shSFRP5)。

1.2.2 细胞葡萄糖摄取实验：将Hepa1- 6细胞接种于24孔板中，细胞汇合到80%左右，用病毒感染细胞48 h后，用葡萄糖氧化酶法-过氧化物酶法(GOD-POD)测定各组Hepa1- 6细胞的葡萄糖摄取率。将细胞用人工合成胰岛素(100 nmol/L)刺激6 h，收取每孔上清液并离心，按照葡萄糖试剂盒的操作步骤将R1，R2按照4∶1比例混合成工作液并加入96孔板中，再加入离心后的各样本培养液上清，用酶标仪检测吸光度值，波长为550 nm。根据公式：葡萄糖浓度(Glu)(mmol/L)=标准品浓度×(样本OA值-空白OA值)/(标准品OA值-空白管OA值)计算葡萄糖浓度。

1.2.3 实时定量PCR(real-time PCR)检测细胞内SFRP5、PEPCK、G6Pase基因的mRNA相对表达水平：6孔板内细胞增殖到约80%，经SFRP5过表达和抑制病毒分别作用2 d后，用1 mL/孔Trizol收取细胞并提取总RNA，反转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行real-time PCR反应。以每个样本的循环数与β-actin循环数的Ct值的比值作为该样本mRNA表达的相对数值。

1.2.4 Western blot实验检测细胞内糖异生及胰岛素信号通路的变化：6孔板内细胞汇合到80%左右，经SFRP5过表达和抑制病毒分别作用72 h后，用100 mmol/L胰岛素处理细胞10 min，再用细胞蛋白裂解液RIPA+磷酸酶抑制剂提取细胞总蛋白。总蛋白经SDS-PAGE分离蛋白质，接着转膜和封闭后将PVDF膜与配制好的一抗稀释液(SFRP5稀释比例1∶100；PEPCK、G6Pase、p-InsR、t-InsR、p-AKT、t-AKT和β-actin均为1∶1 000)至于4 ℃冰箱孵育过夜。次日用TBST洗脱多余的一抗稀释液3次，每次洗脱10 min，再将PVDF膜与二抗稀释液(1∶2 000)置于37 ℃孵育1 h后，用TBST洗脱多余抗体稀释液，步骤同上。随后加ECL试剂反应，在化学发光仪上显影，成像。图像以β-actin为内参，用Quantity One分析软件计算条带吸光度值对各蛋白进行定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SFRP5过表达及抑制病毒的感染效率

Hepa1- 6细胞经Ad-SFRP5病毒或Ad-shSFRP5病毒分别作用2～3 d后与空载病毒对照组(Ad-GFP)相比，实验组细胞中SFRP5基因的mRNA水平和蛋白相对水平均相应增高或降低(P<0.01)(图1)。

2.2 葡萄糖摄取实验

与空载病毒组相比，SFRP5过表达组培养基中的葡萄糖浓度明显降低(P<0.01)，而SFRP5抑制组则呈现葡萄糖摄取障碍(图2)。

2.3 Hep1- 6细胞肝糖异生指标检测

与Ad-GFP组相比，Ad-SFRP5组糖异生指标PEPCK和G6Pase的mRNA和蛋白相对表达水平均明显降低(P<0.05,P<0.01)，而Ad-shSFRP5组则呈明显增高(P<0.01)(图3)。

2.4 Hep1- 6细胞胰岛素信号通路检测

与Ad-GFP组相比，Ad-SFRP5组胰岛素受体(InsR)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平均明显增强(P<0.01)，而Ad-shSFRP5组相反(P<0.05,P<0.01)(图4)。

A.effects of over-expression SFRP5(Ad-SFRP5) on SFRP5 mRNA and protein expression; B.effects of knockdown SFRP5(Ad-shSFRP5) on SFRP5 mRNA and protein expression;*P<0.01 compared with Ad-GFP group

3 讨论

分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)是一种新型抗炎脂肪因子，它是Wnt信号通路的内源性抑制子，可防止代谢紊乱，与机体代谢具有密切相关性[5]。SFRP5在小鼠的白色脂肪组织中呈现高表达，在多种肥胖鼠模型中，脂肪组织中的SFRP5表达降低[1]。亦有临床研究报道，在中国肥胖和2型糖尿病人群中，血浆SFRP5水平呈下降趋势，是影响机体糖脂代谢、炎性反应和胰岛素抵抗的独立因素[5- 6]。而肝脏是人体代谢的重要器官，同时也是胰岛素作用的主要靶器官之一，因此，以小鼠肝癌细胞系Hepa1- 6作为研究载体，旨在探索SFRP5在糖代谢及胰岛素应答方面的作用。

A.effects of over-expression SFRP5(Ad-SFRP5) on glucose uptake; B.effects of knockdown SFRP5(Ad-shSFRP5) on glucose uptake;*P<0.01 compared with Ad-GFP group

A.effects of over-expression SFRP5(Ad-SFRP5) on PEPCK and G6Pase mRNA expression; B.effects of over-expression SFRP5(Ad-SFRP5) on PEPCK and G6Pase protein expression; C.effects of knockdown SFRP5(Ad-shSFRP5) on PEPCK and G6Pase mRNA expression; D.effects of knockdown SFRP5(Ad-shSFRP5) on PEPCK and G6Pase protein expression;*P<0.05,**P<0.01 compared with Ad-GFP group

A.effects of over-expression SFRP5(Ad-SFRP5) on p-InsR/t-InsR and p-AKT/t-AKT; B.effects of knockdown SFRP5(Ad-shSFRP5) on p-InsR/t-InsR and p-AKT/t-AKT;*P<0.05,**P<0.01 compared with Ad-GFP group

2型糖尿病的主要病因为胰岛素抵抗，主要表现为胰岛素促使葡萄糖摄取和利用效率降低，机体代偿分泌过多胰岛素导致高胰岛素血症。为了探索SFRP5在糖代谢中产生的作用，本研究测定Hepa1- 6细胞葡萄糖摄取率，结果显示SFRP5参与Hepa1- 6细胞的葡萄糖代谢，SFRP5上调可以减轻糖代谢负担，而抑制SFRP5则会加重细胞糖代谢紊乱。

磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)和葡萄糖- 6-磷酸酶(G6Pase)是肝脏糖异生途径的关键酶，被广泛用于评估肝脏糖异生水平[7- 8]。2型糖尿病通常会出现肝脏糖异生增强，葡萄糖输出增加。本研究检测Hepa1- 6细胞中PEPCK和G6Pase的表达变化，结果显示，SFRP5过表达可以抑制肝细胞糖异生途径，改善糖代谢紊乱。

为了进一步探索SFRP5与胰岛素抵抗的关系，本研究检测Hepa1- 6细胞胰岛素信号通路的关键因子胰岛素受体(InsR)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平变化。结果表明过表达SFRP5可以增加胰岛素信号通路InsR/AKT的活性，改善胰岛素抵抗状态，增强细胞胰岛素敏感性。

综上所述，小鼠肝癌细胞Hepa1- 6中SFRP5基因过表达可增强肝细胞葡萄糖摄取率，减轻肝细胞糖代谢负担，抑制肝细胞糖异生途径，改善糖代谢紊乱，活化经典胰岛素信号通路，增强胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗；而抑制SFRP5则呈现相反现象。因此，此次研究结果显示，SFRP5在2型糖尿病的发生发展中可能起着重要作用，可为2型糖尿病提供新的治疗靶点，其对糖代谢的具体调控机制还需进一步深入研究。