罗 涛，杨亚冬，杨 耿，唐 靓，李跃中，张文元*

(浙江省医学科学院 1.生物工程研究所； 2.保健食品研究所，浙江 杭州 310013)

肺脏疾病是目前发病率和病死率较高的疾病之一[1]，多种肺脏疾病发展到终末阶段常可导致患者死亡[2- 3]，而此时肺移植是唯一有效的治疗措施[4]。但是等待移植的人数远远超过了合适的供源数量，而且肺移植的术后感染并发症发生率偏高[5]，患者还要面对免疫抑制、慢性排斥和潜在的疾病传播等不利因素，严重影响患者的预后[6]。应用组织工程技术构建的人工肺替代移植肺将成为肺移植治疗的新方向。但是，目前肺组织工程研究的体内实例相对较少，组织工程肺的研究尚无重大进展[7- 8]。本实验对新生兔肺成纤维细胞-海藻酸钠-明胶共混物三维(3D)生物打印的水凝胶结构体片段进行了初步的研究，以便为肺脏的再生研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

3D生物打印机(图1，GESIM公司)，海藻酸钠、明胶和Ⅳ型胶原酶(Sigma-Aldrich公司)；无水CaC12(上海凌峰化学试剂有限公司)；钙黄绿素-AM(calcein-AM，CAM)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)(Solarbio公司)；低糖-DMEM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)。新西兰白兔，1日龄，体质量约160 g，雌雄不限[浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)2013- 0055号]。

图1 3D生物打印机Fig 1 3D bioprinter

1.2 方法

1.2.1 新生兔原代肺成纤维细胞的提取与传代：新生兔断头处死后，浸入75%乙醇5 min。无菌操作下剖腹取出肺脏，冰浴条件下，修剪周边，反复冲洗，直至肺组织发白。将肺组织剪碎约为1 mm×1 mm×1 mm的细小组织块，用PBS反复冲洗至 PBS 液变为澄清。加入3倍于肺组织体积的0.1% Ⅳ型胶原酶，混匀，37 ℃消化20 min。组织块经培养基清洗后，移至已预先铺有鼠尾Ⅰ型胶原的25 cm2塑料培养瓶中，均匀平铺于培养瓶底部。然后将培养瓶底面朝上，加入4 mL含10% FBS的完全培养基，37 ℃，5% CO2培养箱中静置3 h后，将培养瓶轻轻翻正恢复正常。并向瓶内补加少许培养基，进行原代静止培养。24 h后补加培养液，以后每3天换液1次。当原代培养的细胞长至接近汇合时，弃去培养液与组织块，D-PBS冲洗细胞，胰蛋白酶消化，传代培养。

1.2.2 兔肺成纤维细胞共混物的制备：用0.9%氯化钠溶液分别溶解海藻酸钠、明胶干粉，配置终浓度为75 g/L海藻酸钠和25 g/L明胶的混合溶胶，玻璃棒搅拌均匀，每天70 ℃，30 min间歇灭菌，连续3 d，制备海藻酸钠-明胶水溶胶。将第2代兔肺成纤维细胞通过台盼兰染色和计数，确认细胞存活率大于90%后，将细胞悬液与海藻酸钠-明胶水溶胶混合，轻柔混匀，得到细胞浓度为1×107cells/mL的兔肺成纤维细胞-海藻酸钠-明胶水溶胶共混物(简称肺成纤维细胞共混物)。

1.2.3 3D结构体的CAD建模与控制参数：打印机基于微流连续挤出的生物绘图技术，首先进行3D生物打印结构体的CAD建模。拟构建内部结构为网格状的结构体，尺寸大小为9 mm×9 mm×1.2 mm，该网状结构体由圆柱状微丝逐层交错堆积形成，微丝交错构成的孔隙大小设定为600 μm×600 μm。3D生物打印成形过程的主要控制参数：成形温度10 ℃，打印喷头内径为0.26 mm，打印速率为17 mm/s，挤出压力370 kPa，上升层高为0.17 mm，料桶温度32 ℃，与打印喷头相连。

1.2.4 3D生物打印肺成纤维细胞结构体：将肺成纤维细胞共混物置于3D生物打印机的料桶中，按照预先设定的CAD数字模型及成形参数，由空气气压推动柱塞水溶胶挤出成形。将肺成纤维细胞共混物挤出圆柱状微丝，逐层交错堆积于无菌6孔培养板中，形成三维网状结构体。挤出的共混物因明胶的温度敏感性发生物理交联，由溶胶转变为凝胶。打印后立即用5% CaCl2溶液交联5 min，0.9%氯化钠溶液漂洗3次。获得肺成纤维细胞-海藻酸钠-明胶三维结构体(简称肺成纤维细胞结构体)，并浸入完全培养基培养，隔天换液。

1.2.5 肺成纤维细胞结构体的观察：先对上述打印的肺成纤维细胞结构体进行肉眼观察，然后行倒置相差显微镜观察。将培养24 h、10 d的肺成纤维细胞结构体用LIVE/DEAD双荧光染色剂(含5 μmol/L的钙黄绿素-AM和3 μmol/L碘化丙啶) 37 ℃染色30 min。用荧光倒置显微镜(Olympus，IX73)分别在488 nm(钙黄绿素-AM的激发波长)和543 nm(碘化丙啶的激发波长)的激发光下对结构体进行观察，保存图像，并合并这两个激发波长的图像。分别任选5个图像，计数图像中的红和绿荧光点(红和绿光点分别代表死细胞和活细胞)的个数，计算3D生物打印后肺成纤维细胞的存活率，细胞存活率=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

图2 原代肺成纤维细胞从组织块爬出Fig 2 Primary pulmonary fibroblasts creeping out tissue block(×100)

2 结果

2.1 兔肺成纤维细胞原代与传代培养观察

肺组织块能紧密贴壁于培养瓶底面。组织小块接种2 d时倒置显微镜下可见少量梭形细胞从组织块周围逸出，3 d时组织块周围有许多成纤维细胞爬出(图2)，以梭形为主，增殖迅速。成纤维细胞呈放射状贴壁增殖，绝大多数为梭状排列，且排列具有方向性，并有伪足样突起，折光性强，具有成纤维细胞的形态学特征。随着时间的推迟，成纤维细胞不断从组织块周边溢出，逐渐密集，7 d时细胞接近汇合，9 d时高度汇合，即可进行传代。传代4～5 d后，成纤维细胞呈旋涡状生长，为梭形细胞，几乎长满整个培养瓶(图3)。

图3 第二代肺成纤维细胞呈旋涡状增殖Fig 3 The 2nd generation of pulmonary fibroblasts had a vortex-like proliferation(×100)

2.2 肺成纤维细胞结构体的观察

通过3D生物打印技术，获得大小约为9 mm×9 mm×1.2 mm半透明网格状的肺成纤维细胞-海藻酸钠-明胶三维结构体(图4)。倒置显微镜下可见结构体中孔隙的尺寸在600 μm×600 μm左右(图5)。

图4 肺成纤维细胞-海藻酸钠-明胶三维结构体Fig 4 3D structure of pulmonary fibroblast-sodium alginate-gelatin-gelatin

图5 三维结构体的倒置显微镜观察Fig 5 An inverted microscope observation of 3D structure(×100)

2.3 肺成纤维细胞结构体的细胞存活率

肺成纤维细胞三维结构体打印24 h后，可见结构体内细胞均匀分布，绝大部分细胞呈绿色荧光染色(为活细胞)，极少数细胞染成红色(为死细胞)(图6)。对活细胞和死细胞进行计数，细胞存活率为84%±3%。打印10 d后，可见结构体内细胞继续增殖，死细胞稍有增多(图7)，细胞存活率为81%±3%。

图6 打印24 h后肺成纤维细胞结构体荧光染色Fig 6 Fluorescence staining of lung fibroblasts structure printed after 24 hours(×100)

图7 打印10 d后肺成纤维细胞结构体荧光染色Fig 7 Fluorescence staining of lung fibroblasts structure printed after 10 days(×100)

3 讨论

利用携带细胞的3D生物打印技术中“离散-堆积”制造思想，采取“分层打印，层层叠加”，能有效控制支架的微观结构和理化性质，它可在宏观上控制不同细胞和不同材料在三维空间中的定点排布，微观上构建具有适合细胞生存的微环境，使得复杂组织和器官的体外再造成为可能。

本实验使用新生兔第2代肺成纤维细胞-海藻酸钠-明胶共混物，3D生物打印兔肺成纤维细胞水凝胶结构体片段。虽然3D打印技术在其他器官系统组织工程中，已经有生物材料应用于人体内[9- 10]，但是构建肺泡复杂的三维结构仍然是个挑战[11]。此前的研究已经证明移植的组织工程替代物首先在渗透的组织液中获取营养物质，最后通过从移植物周围正常组织长入的血管获取营养。在移植的早期阶段，移植物的中心部分要经历缺血性损伤，大部分细胞将会死亡[12]。因此即使通过3D打印技术精准构建出肺泡复杂的空间结构，后续细胞的存活问题依然有待于解决[13]。本实验结构体设计成网格状框架结构，便于营养物质的渗入和细胞代谢废物的排除，从而提高细胞培养过程中的存活率，同时也有利于细胞的增殖。

海藻酸钠-明胶混合水凝胶类材料具有可塑性，可通过挤压方式成型，并可通过温度和交联剂控制其交联过程[14]。本实验辅以热交联和浸没离子交联技术相结合。明胶具有温度敏感性，在打印过程中，因温度较低，明胶发生热可逆的物理交联，由溶胶转变为凝胶，使支架保持一定的硬度，从而结构体得以成形。以便在海藻酸钠的CaCl2交联之前提高支架的力学性能，使支架保持一定的硬朗度，以避免结构塌陷。最后经CaCl2溶液浸泡交联，结构体中的海藻酸钠转变为海藻酸钙凝胶，使结构体得以稳固。同时明胶含有细胞识别黏附位点RGD序列，能够提高细胞的黏附行为[15]。

钙黄绿素-AM和碘化丙啶是用于细胞活死染色的典型荧光指示性染料，分别发射绿色荧光(代表活细胞)、红色荧光(代表死细胞)，以评价细胞存活率。本实验结果表明，细胞打印技术对肺成纤维细胞损伤较小。打印24 h后，细胞存活率约为84%±3%。打印10 d后，可见结构体内细胞继续增殖，死细胞稍有增多。通过3D生物打印，肺成纤维细胞-海藻酸盐-明胶共混水凝胶可构建出具有自定义形状和尺寸，可控活细胞密度的三维结构体片段。