陈 英，乔 军，孟庆玲*，钟文强，刘田莉，贡莎莎，王熙凤，黄运福，才学鹏

(1.石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室，新疆 石河子 832003；2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046)

【研究意义】细粒棘球蚴病俗称包虫病，是由细粒棘球绦虫的幼虫——细粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus,Eg)寄生于哺乳动物脏器内所引发的严重危害人体健康与畜牧业发展，呈全球性分布的一种人畜共患寄生虫病。我国是受该病影响最为严重的国家之一，其中新疆是发病率最高的地区之一[1]。该病不仅严重影响着居民的健康生活，而且致使许多患者家庭因病返贫，对当地的社会经济发展造成了严重的影响。由于包虫病具有发病缓慢、易传播的特点，给该病的防控带来了较大的困难[2-3]。【前人研究进展】研发有效的诊断试剂是该病防控的关键。目前，已被发现和鉴定的对于包虫病的免疫诊断所用抗原主要是通过粗提囊液蛋白、原头节而获得的，虽然具有很高的敏感性，但和其它寄生虫病患者血清存在严重的交叉反应，导致诊断的特异性不够理想[4-5]。因此，筛选灵敏性强、特异性高的抗原显得尤为重要。有研究发现，EgHSP20抗原基因可在六钩蚴阶段高效表达[2]，为弄清EgHSP20是否具有反应原性，【本研究切入点】本试验对EgHSP20基因进行克隆，分析其重要的功能位点、结构域以及抗原表位等分子特征，并在大肠杆菌中进行诱导表达，鉴定了重组蛋白EgHSP20的反应原性，【拟解决的关键问题】为深入研究EgHSP20重组蛋白在包虫病诊断中的潜在价值奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株与试剂

表达载体pET-32a、菌株E.coliDH5α和E.coliBL21均由本实验室保存；组织总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、T4 DNA 连接酶、PCR 反应试剂、pMD19-T载体、限制性内切酶EcoR I 和HindⅢ均购自TaKaRa公司。cECL Western Blot Kit与辣根酶标记的兔抗绵羊IgG购自北京康为世纪生物公司。蛋白纯化试剂盒购自德国 Novagen 公司。绵羊细粒棘球蚴病阳性血清由中国农科院兰州兽医研究所提供。

1.2 Eg HSP 20的引物设计

根据GenBank发表的EgHSP20基因序列，经引物设计软件Premier 5.0设计绵羊细粒棘球蚴EgHSP20基因抗原(APAU02000015.1)的特异性引物。上游引物为：GGAATTCATGTCGATTTTCCCTGTTC(斜体为保护性碱基，下划线为EcoR I酶切位点)，下游引物为：CCCAAGCTTTCATTTAAAGAGAGGTGCC(斜体为保护性碱基，下划线为HindⅢ酶切位点)；引物由(北京)华大基因科技股份有限公司合成。

1.3 Eg HSP 20基因的RT-PCR扩增

将Eg囊液于离心管中，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，将沉淀(含有原头蚴的样本)根据组织总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，反转录试剂盒反转录成cDNA。采用20 μl RT-PCR反应体系：H2O 9 μl，PCR Mixture 8 μl，cDNA模板2 μl，上下游引物各0.5 μl。EgHSP20基因PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min 15 s，33个循环；72 ℃延伸10 min； 将PCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳，通过DNA 回收试剂盒对PCR产物纯化回收。

1.4 目的基因的序列测定及分析

将纯化回收后的EgHSP20目的基因片段和pMD19-T载体于4 ℃过夜连接后转入E.coliDH5α感受态细胞，经菌液PCR筛选阳性克隆菌，提质粒，经双酶切验证后进行测序。将测序结果用MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan) 预测编码蛋白的糖基化、磷酸化修饰位点；DNASTAR (Jameson Wolf方法)对其抗原表位进行预测。通过TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 进行结构域预测。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽；对不同物种间的EgHSP20氨基酸序列进行同源性比对与分析。通过MEGA5.0软件(Neighbor-joining Method)进行系统进化树分析(bootstrap为1000)。

1.5 重组质粒pET-Eg HSP20的构建与鉴定

将测序正确的pMD-EgHSP20质粒与原核表达载体pET-32a经内切酶EcoR I 和HindⅢ于37 ℃条件下分别进行双酶切，并分别回收EgHSP20目的基因片段与载体片段，经T4 DNA连接酶4 ℃连接过夜后转至E.coliDH5α感受态细胞中，于氨苄抗性平板37 ℃过夜培养，挑取单个菌落，通过PCR和双酶切方法筛选阳性克隆。

1.6 重组蛋白的诱导表达、纯化及Western blot鉴定分析

将重组质粒pET-EgHSP20转化至E.coliBL21感受态细胞中，加入终浓度为1.0 mmol/L的诱导剂IPTG进行诱导表达。在诱导0、4、6、8 h后分别收集菌体和菌液，进行SDS-PAGE分析鉴定。用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，转至硝酸纤维素膜上，用脱脂奶粉(10 %)封闭2 h，加一抗(包虫病绵羊阳性血清)室温孵育 1～2 h，TBST buffer 洗涤 3～5 次，加入HRP 标记的兔抗绵羊 IgG，室温孵育 2 h 后用TBST buffer 洗涤 3～5 次，加入显色剂避光显色1～2 min。经Western blot鉴定，分析重组蛋白的反应原性。

2 结果与分析

2.1 Eg HSP20基因的RT-PCR扩增

琼脂糖凝胶电泳可检测到约945 bp的目的条带，与GenBank中公布的EgHSP20基因片段大小相符(图1)。将目的条带纯化回收，克隆至pMD19-T载体内，转至(E.coliDH5α)感受态细胞中，经菌液PCR鉴定筛选阳性克隆菌。

2.2 Eg HSP20基因的序列测定及分析

经测序，EgHSP20 cDNA开放阅读框为945 bp，编码314个氨基酸。同源性分析软件比对发现，与GenBank中发表的EgHSP20基因序列同源性达99.05 %。在第66～71个碱基处由CCCCCC变为GAGTTT。在第74个碱基处由C变为G。在第269个碱基处由G变为A。该蛋白含有1个N端糖基化位点，1个CAMP磷酸化位点，5个PKC磷酸化位点，10个CKⅡ磷酸化位点；抗原表位区集中在39～53、120～168位(图2)。该蛋白无跨膜区域，无信号肽。EgHSP20和其它寄生虫间氨基酸序列的比较及遗传进化分析显示，EgHSP20与牛带绦虫(TaeniasaginataHSP20，TaensagHSP20)位于同一遗传分支，二者的亲缘关系最近，同源性为86 %；而与肝片吸虫、口膜壳绦虫、华支睾吸虫、日本血吸虫、口膜壳绦虫、曼氏裂体吸虫及卫氏并殖吸虫的HSPs均低于40 %(图3～4)。

M：DNA分子质量标准； 1～2：RT-PCR扩增产物图1 Eg HSP20基因RT-PCR扩增产物Fig.1 Amplification of Eg HSP 20 gene by RT-PCR

2.3 Eg HSP 20基因重组质粒的构建与鉴定

经菌液PCR筛选鉴定阳性重组菌(图5)。通过EcoR I /HindⅢ双酶切验证得到 945 bp的目的条带和 5900 bp 的pET-32载体片段(图6)，表明已成功构建重组原核表达载体pET-EgHSP20。

2.4 重组蛋白Eg HSP 20在大肠杆菌中的诱导表达与纯化

IPTG分别诱导0、4、6、8 h后， SDS-PAGE检测分析结果显示，重组蛋白EgHSP20相对分子质量约为51 kDa，6 h时表达量最高。可溶性分析显示，重组蛋白EgHSP20主要以包涵体形式存在。Western blot分析结果显示，在相对分子质量约51 kDa处出现特异性的单一反应条带，显示重组蛋白能和绵羊Eg阳性血清发生特异性的反应，表明重组蛋白EgHSP20具备良好的反应原性(图7)。

引物序列(下划线)；N端糖基化位点(虚线框)；CAMP磷酸化位点(双下划线)；PKC磷酸化位点(灰色阴影部分)；CKⅡ磷酸化位点(波浪线)；抗原表位集中区(方框)图2 Eg HSP20 cDNA核苷酸序列及其推导的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of Eg HSP20 cDNA

Eg HSP20:细粒棘球蚴；Fashe HSPs:肝片吸虫；Hymic HSP20:口膜壳绦虫；Clonorchis sinensis:华支睾吸虫；Schi jap HSP 20:日本血吸虫；Hym mic HSP20:口膜壳绦虫；Schi man HSP20:曼氏裂体吸虫；Parwes egg antigen:卫氏并殖吸虫；Taenia saginata HSP20:牛带绦虫图3 不同寄生虫HSP20蛋白氨基酸序列比较Fig.3 Comparison of amino acid of HSP20 protein among different parasites

Eg HSP20:细粒棘球蚴；Fashe HSPs:肝片吸虫；Hymic HSP20:口膜壳绦虫；Clonorchis sinensis: 华支睾吸虫；Schi jap HSP 20:日本血吸虫；Hym mic HSP20:口膜壳绦虫；Schi man HSP20:曼氏裂体吸虫；Parwes egg antigen:卫氏并殖吸虫；Taen sag HSP20:牛带绦虫图4 几种代表性寄生虫HSP20蛋白基因系统进化树Fig.4 Phylogenetic analysis of several representative worm based on HSP20 gene

3 讨 论

目前已被发现与鉴定的Eg抗原主要包括囊液粗提抗原、原头节、抗原5、Eg95、Eg10和EgAgB等[2-4]。Zhang等通过临床实验已证实囊液粗提抗原的敏感性为75 %～95 %，但其特异性比较差，存在一定缺陷，能和多房棘球绦虫、猪带绦虫等其它绦虫病、线虫及吸虫等存在交叉反应，影响实际诊断的准确性。而抗原5、Eg10和EgAgB等重组抗原特异性较高，但敏感性较低，给确诊带来困难[2]。因此，筛选具有强反应原性的细粒棘球蚴特异性抗原显得尤为重要[6]。

M: DNA分子质量标准; 1～4: 菌液PCR产物图5 pET-Eg HSP20载体PCR鉴定Fig.5 Identification of pET-Eg HSP 20 by PCR

HSPs是生物体在不利于自身因素刺激下所产生一种可溶性的应激蛋白。正常状态下在细胞内发挥着重要的生理功能，应激时呈现高表达，有着应激保护作用[7-8]。且能作用于抗原提呈细胞而刺激细胞因子的分泌，参与免疫细胞的发育、分化与激活[9-12]。有研究发现，许多寄生虫的热休克蛋白(HSPs)不仅参与蛋白的折叠、转运、细胞的凋亡[13-15]、机体免疫等多种生理功能[16-18]，而且还具有较强的免疫原性，在基因疫苗中还可提高免疫效能的专一性，是当前研究热点[19-21]。Snoeckx 等(2001)根据氨基酸序列结构、生物功能与相对分子质量的大小，将 HSPs分为小分子 HSP、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110等家族[10,14]。其中HSP70已被证实对血吸虫、疟原虫、锥虫等寄生虫尤其是对棘球绦虫具有重要诊断应用价值[12-13,17-18]。郭爱疆等(2004)从猪囊尾蚴虫体中扩增出小热休克蛋白，经研究证实该蛋白能够和猪囊虫患畜血清发生特异性反应，具有良好的反应原性[16,22-23]。HSP20属于小分子热休克蛋白家族的一员，在六钩蚴和原头蚴阶段表达量明显超过了HSP70，在细粒棘球绦虫虫卵中发挥着重要作用[2]。

M：蛋白分子质量标准；1：pET-32a菌经IPTG诱导8h表达产物；2～5：pET-Eg HSP20菌经IPTG诱导0 、4 、6 和8 h表达产物；6～7：pET-Eg HSP 20菌经IPTG诱导8 h超声破碎后上清和沉淀；8：纯化的重组蛋白；9：Western blot分析图7 目的蛋白Eg HSP 20 SDS-PAGE和Western blot分析Fig.7 Analysis of recombinant protein Eg HSP 20 by SDS-PAGE and Western blot

4 结 论

为寻找特异性高、敏感性强的包虫病诊断抗原奠定基础，本实验筛选出了在细粒棘球蚴幼虫阶段热休克蛋白家族中表达量较高，且至今尚未被深入研究的Eg-HSP20基因进行克隆，测序后对它重要的功能位点、结构域、信号肽及抗原表位进行生物信息分析，成功构建了pET-Eg-HSP20原核表达载体，实现了在E.coliBL21中高效表达。SDS-PAGE可检测到约51 kDa蛋白大小的特异性条带；Western blot鉴定显示，Eg-HSP20重组蛋白能够特异性的识别Eg阳性血清，证实此蛋白具有良好的反应原性，具有作为包虫病诊断候选抗原分子的潜在价值。