高俊峰，高忠燕，王丽坤，张显光，崔宇超，侯美如

(1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔161005；2.扎龙国家级自然保护区管理局，黑龙江齐齐哈尔161002)

枝双腔吸虫(Dicrocoelium dendriticum)属于双腔科(Dicrocoeliidae)双腔属(Dicrocoelium)，是一种食源性人兽共患寄生虫病原，主要寄生于终末宿主的胆囊和胆管，引起双腔吸虫病，宿主呈渐进性消瘦和消化不良，进而造成肉和奶的产量下降以及幼畜的死亡[1]。枝双腔吸虫的终末宿主范围比较广泛，主要感染牛和羊，此外，兔子、猫、狗、猪、马和人也可感染，一些野生动物如鹿、骆驼、羊驼也有感染枝双腔吸虫的报道[2-3]。因此，枝双腔吸虫不仅给畜牧产业造成经济损失，对人类和野生动物的生命健康也具有一定的威胁。

国内关于枝双腔吸虫的报道极少，仅在青海高原[4]和黑龙江省牡丹江地区[5]有枝双腔吸虫的报道，而且主要集中于流行病学调查和形态学鉴定，这可能与形态学鉴定困难，容易造成误判有关。双腔吸虫属的枝双腔吸虫、中华双腔吸虫和矛形双腔吸虫在形态学上较为相似，并且均可以感染羊[6]，这给鉴别检测带来了一定的难度。核糖体DNA (rDNA)作为一个实用的分类工具，能够显示出不同寄生虫之间的种内差异和种间差异，其中，内转录间隔区(Internal transcribed spacer region，ITS)序列可作为较好的基因标记，已广泛应用于寄生虫的遗传进化分析[7]。因此，本研究拟对齐齐哈尔地区绵羊胆管中分离的吸虫通过形态学结合分子生物学方法进行鉴定，并基于ITS-2 序列进行分子进化研究，为双腔吸虫的流行病学调查和分子鉴别诊断提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 虫 体 2017 年8 月，于黑龙江省齐齐哈尔市周边某羊场剖检病死成年绵羊，于胆管中收集到大量新鲜虫体，经生理盐水冲洗后，保存于70 %乙醇中固定备用。

1.2 主要试剂 苏木素染液购自Biosharp 公司；Tissue DNA Kit 购自OMEGA bio-tek 公司；ExTaqDNA 聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker、pMD18-T 载体均购自宝生物工程(大连)有限公司；AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒、质粒小量制备试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。

1.3 吸虫的形态学鉴定 采用苏木素染色法[8]将乙醇固定的虫体染色后制作成装片，于显微镜下观察，记录虫体形态，根据形态学鉴定要点进行鉴定。

1.4 rDNA ITS 基因序列的PCR 扩增及分析 取5条成虫样品，分别置于无菌离心管中，利用DNA提取试剂盒提取虫体总DNA，提取的DNA 样品放置于-20 ℃保存备用。

以提取的DNA 为模板，利用通用引物NC5：5'-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3'/NC2：5'-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3'，PCR 扩增ITS 基因序列。反应体系为25 μL；反应条件为：92 ℃2 min；92 ℃30 s、50 ℃30 s、72 ℃1 min 20 s，共35 个循环，72 ℃延伸5 min。PCR 产物经1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化回收。纯化后连接于pMD18-T 载体中，转化至DH5α 大肠杆菌感受态细胞内，筛选阳性重组菌，提取质粒，经PCR 鉴定后，阳性质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司双向测序。利用生物学软件DNAStar，参照NCBI 中相关吸虫ITS 序列，对测序结果进行比对分析，确定ITS 各段的大小，将ITS-1 和ITS-2 序列拼接，与NCBI 中同源性最高的吸虫ITS 序列进行比对分析。

将获得吸虫的ITS-2 基因序列与NCBI 中相关序列进行比对分析，以斜睾目背孔科背孔属Notocotylus malhamensis(JQ766940)作为外群，利用Clustal X 1.83 和MEGA 5.1 软件绘制遗传进化树，探究本研究分离吸虫的系统发生位置。

2 结果与讨论

2.1 吸虫的形态学鉴定 采用苏木素染色法将虫体染色后制作成装片经显微镜观察，结果显示本研究的虫体形态与文献[6]中枝双腔吸虫的描述一致，虫体呈肩纺锤形。有口、腹吸盘，从腹吸盘到虫体后端，虫体的宽度几乎一致。两睾丸在腹吸盘后呈斜列排布，睾丸分瓣，从睾丸引出的小输精管在腹吸盘上会合后伸进阴茎囊，阴茎囊大而发达，与子宫末端共同开口于肠分叉处后方。卵巢位于睾丸后方，成块状。两束卵黄腺呈细枝条状，分布于虫体两侧。子宫较为发达，由许多上行和下行的子宫圈组成，几乎充满生殖腺与肠管之间的全部缝隙(图1)。该结果表明本研究分离的吸虫在形态学上鉴定为枝双腔吸虫。

枝双腔吸虫与中华双腔吸虫、矛形双腔吸虫同属于双腔科双腔属，终末宿主主要为反刍动物。它们在形态学上较为相似，唐崇惕等[6]描述3 种双腔吸虫形态和睾丸的排列方式存在差异，枝双腔吸虫虫体形态呈纺锤形或椭圆形，睾丸呈分支斜列；中华双腔吸虫虫体形态呈纺锤形，睾丸呈并列状；矛形双腔吸虫虫体呈长矛形，睾丸呈团块状前后排列。本研究分离的双腔吸虫参照以上鉴定要点初步鉴定为枝双腔吸虫。然而，Otranto 等报道的枝双腔吸虫虫体呈长矛形，睾丸排列方式为前后排列，分子生物学鉴定同样为枝双腔吸虫[9]；Fakhar 等报道的枝双腔吸虫虫体呈纺锤形，睾丸为前后排列[10]。虫体的形态可能受诸多因素影响，如：虫体的寿命、营养条件、感染程度、地理分布、不同的发育阶段、检测方法、时间和地点等，因此，仅凭传统方法鉴定形态上相似的吸虫有一定的困难，为更确切了解本研究分离吸虫的分类地位，需要从分子水平上做进一步鉴定。

图1 枝双腔吸虫形态学观察Fig.1 Morphology of the trematode isolated in this study

2.2 rDNA ITS 基因序列的扩增及分析 利用通用引物扩增5 条吸虫的rDNA ITS 序列，产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，扩增的条带均出现在约1 000 bp 的位置，与预期目的片段一致，且无非特异性条带。基因片段经测序后经人工校正，得到完整的ITS 序列，5 条虫体的ITS 序列完全一致，全长为1 144 bp，通过与NCBI 中其它ITS 基因序列比对分析得出ITS-1，5.8s 和ITS-2 大小分别为749 bp，161 bp 和234 bp。将获得的ITS-1 和ITS-2 基因序列拼接后与NCBI 中枝双腔吸虫(KC774522)的ITS-1 和ITS-2 拼接序列进行比对分析，二者同源性可达99.8 %，ITS 全基因序列中存在两处突变，分别为ITS-1 区域的C87T 和ITS-2 区域的A763G。该结果表明本研究分离的吸虫在分子水平上也鉴定为枝双腔吸虫。

2.3 双腔科吸虫系统进化分析 本研究利用ITS-2基因序列作为基因标记构建系统进化树，Notocotylus malhamensis作为外群，与双腔科吸虫明显处于两个不同的分支。本研究分离的吸虫与枝双腔吸虫聚集在一起，种内差异率为0～0.9 %。所有的枝双腔吸虫与双腔属的另外两种吸虫中华双腔吸虫、东方双腔吸虫聚集在一个大分支里，而与同为双腔属的牛双腔吸虫遗传距离稍远，本研究分离的吸虫与双腔属的其它吸虫种间差异率为3.4 %～11.4 %，种间差异明显大于种内差异。双腔属、短腺属和饶氏属的吸虫聚集在一个更大分支内，扁体属和阔盘属聚集在另一个大分支内，本研究分离的吸虫与双腔科其它属吸虫差异率为6.9 %～23.1 %，差异更为明显(图2)。这表明ITS-2 基因序列种内变异很小，种间差异明显，ITS-2 也适合作为吸虫的遗传标尺。

本研究进化树选择来自于不同地区和不同宿主的枝双腔吸虫的ITS-2 基因序列，地域上主要为欧洲和亚洲地区，宿主包括家养动物和野生动物，进化树显示不同来源的ITS-2 基因序列差异不大，可能是因为枝双腔吸虫种群内存在基因稳定性，这种基因稳定性已被证明存在于其它同样是宿主和地域来源均广泛的寄生虫种群内[11]。中华双腔吸虫和东方双腔吸虫聚集在一个小分支中，这与Bian[1]等的报道结果相一致，表明这两种吸虫很可能为同一个种。而双腔属中牛双腔吸虫与其它吸虫遗传距离稍远，与短腺属分离自欧亚鸲的吸虫处于同一个分支，虽然牛双腔吸虫宿主来源也为反刍动物，但依据传统的形态学和宿主进行种属分类可能存在一定的缺陷，由于数据有限，这一推断还有待于进一步验证。

本研究通过对黑龙江省齐齐哈尔地区绵羊体内分离的吸虫进行形态学结合分子生物学鉴定，最终确定所分离的吸虫为枝双腔吸虫，该结果为齐齐哈尔地区双腔吸虫流行病学调查及分子鉴别诊断提供科学的参考依据。

图2 分离的双腔科吸虫系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of Dicrocoeliidae trematode