宋紫暄，李光明，张 静，张卫民，杨吉龙，朱 泽

（1.天津医科大学病原生物学系,天津300070；2.天津市第三中心医院输血科，天津300170；3.天津医科大学肿瘤医院骨与软组织肿瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津300060）

恶性周围神经鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）是一种罕见的高度恶性神经源性软组织肉瘤，约占所有肉瘤的4%[1]；50%的MPNST继发于1型神经纤维瘤（NF1），约10%与患者先前的放射治疗相关[2-3]；截止到目前为止，其余的40%尚没有明确的易感因素。MPNST具有高度恶性，复发率高，转移能力强的特点，5年生存率为50%左右，而5年无病生存率仅为27%[4-6]。MPNST的诊断仍然是一项具有挑战性的工作，并且由于其非特异性的形态学特征并缺乏特异性的IHC分子诊断标记，使得其诊断标记并不成系统。在临床上，当遇到已知易感因素（NF1，RT）以外的MPNST时，其诊断结果则与临床医生个体观察差异密切相关[7]，据以往复杂核型的研究报道，NF1相关的MPNST中S100在50%～90%的病例中表达阳性，或者存在频发的等位基因缺失，但这并不是这些肿瘤的特异性标记[8-9]。MPNST的确切诊断是需要在特定的临床背景下进行的，比如受NF1影响的个体或者之前接受过放射治疗而发生的肿瘤，但当遇到临床背景并不能辅助判断（即散发病例）的情况下，MPNST的诊断则需要依赖其形态学特征进行判断。因此，MPNST特异性标志物的发现对早期诊断以及预后关系重大。现如今，表观遗传调控神经纤维瘤中组蛋白甲基化修饰的研究日益受到重视[10]。组蛋白H3在体内存在单甲基化（me1）、二甲基化（me2）及三甲基化（me3）3种形式，其N-末端赖氨酸残基K27是主要的甲基化修饰位点之一，其甲基化的程度可影响相应区域DNA的转录活性，从而发挥抑制转录的作用[11]。在美国人群[12]与日本人群[13]中的研究发现，H3K27me3在非NF1相关的MPNST中频繁发生表达缺失，很有希望作为诊断MPNST的重要生物标志物。本研究通过应用组织芯片技术制备中国人群MPNST组织芯片，通过免疫组化的方法来研究H3K27me3在MPNST中的表达情况与疾病病理特征之间的关系，并验证H3K27me3的表达缺失在中国人群中是否具有辅助诊断MPNST的价值。

1 材料和方法

1.1 临床资料 收集天津医科大学肿瘤医院病理科自1991年1月-2011年11月恶性周围神经鞘瘤住院病理组织标本43例，经福尔马林固定，石蜡包埋后，利用TMA技术制成组织芯片，其中NF1型的恶性周围神经鞘瘤，是根据美国国立卫生研究院标准进行确诊的，临床资料的收集包括性别、年龄、MPNST的亚型、肿瘤的部位、大小、AJCC分期、放疗、化疗、复发、转移等。其中男性23例，女性20例，最大年龄86岁，最小年龄15岁，平均年龄45.86岁。组织学分型：39例为散发型恶性周围神经鞘瘤，4例为NF1型的恶性周围神经鞘瘤。患者无病生存率和总生存率的时间分布为0～176个月和0～182个月，中位生存时间分别为16个月和64个月。

1.2 主要试剂和仪器 鼠抗人单克隆抗体H3K27me3（ab6002）购自美国abcam公司，工作浓度为1∶100。二抗试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥公司。

1.3 构建MPNST组织芯片 光学显微镜下标记原始病理标本无坏死退变、具代表性的肿瘤区域，每例标本标记2点。用直径1.5mm的打孔针在Quick-Ray预铸受体蜡块上打孔，并在每个供体蜡块标本上按标记取出2份直径为1.5 mm的圆柱体组织块，分别将上述肿瘤组织块移入受体蜡块，构建TMA模块。52℃恒温烤箱中加热组织阵列块1 h，室温条件下冷却30 min后放入-20℃冰箱冷却6 min。切片辅助系统连续切片，每张切片厚4 μm。组织切片移入45℃温水中，待舒展充分后用组织芯片专用载玻片捞片，室温晾干，95℃病理组织漂烘仪烤干，60℃烤片16 h，取出冷却后置于-20℃冰箱贮存备用。

1.4 免疫组化染色 60℃温箱孵育组织切片30min，二甲苯脱蜡，各级浓度乙醇水化，高压蒸汽加热抗原修复，0.3%甲醛/双氧水封闭内源性过氧化物酶。常温下与胎牛血清孵育1 h，滴加抗体H3K27me3（1：100），4℃冰箱过夜。将切片与HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体孵育1 h，4℃冰箱30～40 min。将切片浸入DAB溶液10min，各级浓度乙醇快速脱水，二甲苯透明，加盖盖玻片，中性树脂封片。待晾干后观察。

1.5 结果判读 在无背景染色情况下，以细胞质或细胞核染成黄色至棕褐色细颗粒状为阳性反应。在高倍镜下（×400）对阳性细胞进行评分，随机选择5个视野，总共计数500个细胞。将阳性细胞按所占百分比分为5级：＜5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，＞75%为4分。同时对细胞着色强度进行分级：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕黑色。以两者相加为所得分数：≤1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中等阳性（++），6～7分为强阳性（+++）。阴性（-）和弱阳性（+）为低表达组，而中等阳性（++）和强阳性（+++）为高表达组。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行分析。H3K27me3的表达与临床病理参数之间的关系用χ2检验或Fisher精确概率法检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 非NF1相关性MPNST表现出H3K27me3的表达缺失 运用H3K27me3单克隆抗体进行IHC研究评估，结果显示65.11%（n=28）的MPNST病例显示完全（n=17，39.53%，图1A）或部分（n=11，25.58%，图 1B）染色缺失，而 35%（n=15，图 1C）的病例保留染色，即以H3K27me3表达缺失为诊断依据则MPNST的检出率可达65.11%，且与原诊断一致。然而，在不同的MPNST组中，免疫染色状态有很大差异。当仅考虑与NF1相关的MPNST（n=4）时，4例（100%）显示H3K27me3染色正常，而非NF1相关的MPNST（n=39）中，H3K27me3表达缺失达71.78%（n=28），其中完全缺失病例 43.58%（n=17），部分缺失病例28.20%（n=11），保留表达组病例占28%（n=11），即在非NF1相关的MPNST中检出率可达71.78%。H3K27me3的表达缺失不仅可以诊断MPNST，特别是对于非NF1相关的MPNST可显现出更好的敏感性和特异性。

图1 IHC显示H3K27me3在临床组织样本中的表达情况Fig 1 IHCshowstheexpressionofH3K27me3inclinicaltissuesamples

2.2 MPNST中H3K27me3的表达情况与临床病理参数的关系 本研究共纳入43例MPNST样本。大多数样本（84%）起源于原发性或复发性病变，而16%的样本来自转移性病变。原发肿瘤位于双侧肢体 16例（37%），躯干 20例（47%），头颈部 7例（16%）。6个样本（14%）是放化疗前的状态。此外，包括4个NF1相关样本。按照临床病例数据的不同组别，我们进行了H3K27me3 IHC的统计分析（表1）。研究结果表明，H3K27me3的表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、AJCC分级、放化疗及复发和转移并无关联，而与MPNST是否为NF1型密切相关（P=0.014）。

表1 不同临床病例数据组别的H3K27me3 IHC统计情况（n）Tab 1 H3K27me3IHCstatisticsfordifferentclinicalcasedatasets（n）

3 讨论

最近有研究表明，在MPNST中EED和SUZ12的基因表达异常，均可编码PRC2重要组成部分，这种基因表达异常在诸多临床情况下均有发生[14]。EED和SUZ12的基因表达产物与EZH1/EZH2可构成PRC2复合物的核心，其主要负责组蛋白3的赖氨酸27位点的二甲基化（H3K27me2）和三甲基化（H3K27me3），PRC2参与染色质的压缩，异染色质的形成，X染色体的失活以及多梳介导的基因沉默[15-17]。有研究表明[14]，EED和SUZ12的突变可以使得PRC2失活，从而促使H3K27me3 IHC表达的缺失。我们的结果显示，在所有的MPNST中，65%的病例中H3K27me3表达缺失。此结果相对于前人报道的S100蛋白染色具有相同的价值[8-9]。但是，当考虑到MPNST的各类临床亚型时，在大多数散发的病例中，H3K27me3表达的丧失则具有更高的敏感度，更有趣的是在我们的研究发现4例NF1相关的MPNST样本，IHC染色显示H3K27me3阳性，曾有文献报道称PRC2表达异常在NF1相关的MPNST中发生率较低，仅有60%的病例表现出H3K27me3的表达缺失，40%的病例仍保留了H3K27me3的表达[12]。但是无论NF1相关的MPNST中H3K27me3的表达水平如何，只要我们从实际诊断的角度出发，大多数NF1相关的患者检测为梭形细胞肉瘤基本都可认定为MPNST，而很少再需要其他的辅助因子来进行诊断。

通过研究中国人MPNST组织样本证实了H3K27me3的IHC分析对于MPNST的诊断具有很强的实用性。在某些特定临床情况下，如RT相关性或散发性MPNST，H3K27me3表达的缺失可作为一种十分有意义的辅助标记物，具有很好的敏感性与特异性。该标记对于NF1相关的MPNST敏感性较低，这与NF1相关的MPNST中较低的PRC2失活发生率相关。在我们的H3K27me3的IHC分析结果中，发现在NF1相关的MPNST中H3K27me3的水平明显高于散发MPNST，我们在中国人群中的研究结果与美国Prieto-Granada等[12]和日本Asano等[13]学者的研究结果基本一致，并且若以H3K27me3的表达缺失为诊断MPNST的标准，则其MPNST的整体检出率可达65.11%，在除外NF1相关的MPNST的检测中的其检出率可高达71.78%，显现出十分优异的敏感性和特异性。目前在诊断MPNST的过程中由于非特异性的形态学特征并缺乏特异性的IHC分子标记物，使得诊断工作仍然困难重重，而H3K27me3在MPNST早期诊断中具有灵敏、高效等优势。综上所述，我们认为在中国MPNST发病人群中，H3K27me3亦可作为该疾病早期诊断的辅助工具。