王硕

（天津医科大学肿瘤医院生物化学与分子生物学研究室，国家肿瘤临床医学研究中心，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津300060）

在女性人群中乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，每年将近有160万患者被确诊为乳腺癌，其中30%～40%的乳腺癌患者会发生转移，而超过90%死亡患者发生乳腺癌转移[1]。我国女性乳腺癌的发病率和死亡率在世界范围内处于中低水平，但是乳腺癌仍然是我国女性最常见的癌症之一，发病仅次于肺癌[2]。近年来乳腺癌的发病呈现年轻化的趋势，因此对于乳腺癌的研究也越来越多。在研究乳腺癌的过程中动物模型的构建是研究的关键所在。肿瘤细胞与小鼠品系的选择也是建立乳腺癌动物模型的基础所在，这些选择都会对小鼠的生物学活性、成瘤率、生存期、肿瘤的恶化情况起着决定性的作用[3]。目前的报道多为人的乳腺癌细胞系异种移植到裸鼠的动物模型并且成瘤率也比较低，但是对于小鼠的乳腺癌细胞系4T1接种到裸鼠以及BABL/c小鼠身上相互对比的报道研究比较少。因此使用4T1细胞建立裸鼠以及BABL/c小鼠动物模型对于乳腺癌的研究有十分重要的作用[4-7]。本文就对相同浓度的4T1细胞分别接种到裸鼠和BABL/c小鼠身上产生的不同影响进行对比，从而为乳腺癌动物模型的建立起到一个选择性的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系和试剂 雌性裸鼠以及BABL/c小鼠各 30只，周龄 3～5周，体质量15～18 g，购于南京大学动物模式研究所，饲养于天津医科大学肿瘤医院SPF动物房；4T1乳腺癌细胞株购于中科院细胞库；RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司；胎牛血清和0.25%胰酶购于美国Gibco公司；PBS溶液用1 L超纯 水 加 入 NaCL 8 g、KCL 0.2 g、KH2PO40.2 g、Na2HPO4·12H2O 3.48 g 浓度配置。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养 4T1细胞（中科院细胞库）培养于含有 10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS，Gibco，美国）的 RPMI-1640培养基（Gibco，美国），细胞培养均加入100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素，于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，对数期细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 细胞计数 首先将计数板以及盖玻片擦拭干净，将盖玻片盖在计数板上；然后将细胞悬液吸出20 μL，滴加在盖片边缘，使细胞悬液充满计数板与盖玻片之间（主意盖玻片与计数板之间不能有气泡，也不可将细胞悬液流出）；最后将计数板静止2～3 min后，计算计数板四大格细胞总数，压线的细胞只计左侧和上方的，公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104。

1.2.3 乳腺癌4T1细胞悬液的制备 传代培养的小鼠乳腺癌细胞系4T1,收集处于对数生长期的4T1细胞，用PBS清洗1次后，吸干残余液体，加入0.25%消化，离心，然后再用PBS润洗两次，吸去PBS后再加入生理盐水制备1×106的细胞悬液备用。

1.2.4 动物模型的分组以及构建 将新到的10只裸鼠以及10只BABL/c小鼠给予正常饮食饲养5 d后，分别随机分为4组每组5只，从而得到两组每组5只的裸鼠（一组进行正常实验，一组观察生存期）以及两组每组5只的BABL/c小鼠（一组进行正常实验，一组观察生存期）。将1×106个4T1细胞用生理盐水稀释后，用注射器注射到小鼠的第四脂肪垫上。

1.3 观察指标 注射4T1细胞后，每天观察小鼠的生活饮食以及接种部位的肿瘤生长情况，包括肿瘤出现的时间，肿瘤形成的大小，成瘤率以及远期的存活率。每间隔5 d用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），并且根据V=ab2/2计算肿瘤的体积，绘制生长曲线。第30天时颈椎脱臼处死一组裸鼠一组BABL/c小鼠，取出肿瘤组织，用游标卡尺测量肿瘤的长短径，计算体积，然后4%甲醛固定备用做H&E切片。取出小鼠的肺组织观察记录肺部表面的结节数量，然后用4%甲醛固定备用做H&E切片。

1.4 统计学方法 所得数据采用SPSS25.0统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05（*P＜0.05，**P＜0.01）为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别小鼠的成瘤率以及成瘤时间 接种4T1细胞后裸鼠出现肿瘤的时间要早于BABL/c小鼠，由于BABL/c小鼠存在免疫能力使得裸鼠的成瘤率要高于BABL/c小鼠,具体成瘤率与肿瘤形成时间见表1。

表1 成瘤率及成瘤时间Tab 1 Tumor growth rate and tumor formation time

2.2 肿瘤大小统计以及病理观察 实验结果表明在相同细胞浓度的条件下裸鼠形成肿瘤的大小明显比BABL/c小鼠形成的肿瘤大（图1）。两组原位瘤用4%的甲醛固定3 d后做HE染色，比较两组模型鼠形成的原位瘤组织学是否有区别，发现BABL/c组与裸鼠组形成的原位瘤都存在大量的血管结构，没有明显的组织学差异（图2）。

图1 原位瘤的大小及统计Fig 1 Size and statistics of primary tumor

图2 原位瘤HE染色Fig 2 HE staining of primary tumor

2.3 小鼠肺转移 在30 d颈椎脱臼处死小鼠取原位瘤的同时取肺器官，然后用4%甲醛固定后观察发现在肺表面都会有肺结节的存在，并且在30 d时裸鼠肺部正反双面形成转移结节的数量明显多于BABL/c小鼠（图3）。HE染色组织学分析发现在两组实验小鼠肺转移灶的肿瘤细胞并没有明显差异（图4）。

图3 形成的肺转移结节及数量统计Fig 3 Lung metastasis nodules and the statistics of nodules number

图4 肺转移HE染色Fig 4 HE staining of lung metastasis

2.4 小鼠生存期 剩余两组小鼠用于观察生存期，发现在相同的饲养条件下BABL/c小鼠的生存期明显比裸鼠的生存期长（图5）。

图5 小鼠的生存期Fig 5 Survival of mice

3 讨论

乳腺癌动物模型的构建与选取对于乳腺癌的研究来说一直是重点所在，由于大家对乳腺癌的研究方向不同，所选取的乳腺癌动物模型也不都是相同的[6，9]。在进行乳腺癌相关实验时，细胞系的选择以及小鼠品系的选择是进行体内实验的基础，如果细胞系和小鼠品系的选择不合适可能就会耽误实验进程影响实验结果。现如今技术所能构建的乳腺癌模型主要有自发性乳腺癌动物模型，诱发性乳腺癌动物模型，移植性乳腺癌动物模型，基因工程乳腺癌动物模型以及远处转移乳腺癌动物模型[10]。

本文通过研究小鼠乳腺癌细胞4T1对不同品系小鼠乳腺癌模型的影响，发现在注射相同数量小鼠的乳腺癌细胞4T1时，裸鼠的成瘤速度快于BABL/c小鼠，成瘤率要高于BABL/c小鼠，裸鼠的成瘤大小大于BABL/c小鼠，裸鼠的生存期比BABL/c小鼠要短。两种小鼠在4T1细胞构建的乳腺癌模型中都会发生肺转移，但是在相同时间内裸鼠形成的肺转移结节数量明显比BABL/c小鼠多。

综上实验结果,如果实验要求观察短时间内某基因对肿瘤的大小的影响，可以选择4T1细胞注射裸鼠；如果实验要求动物模型的生存期较长，可以选择4T1细胞注射BABL/c小鼠；如果实验要求观察某基因对动物模型肺转移存在的影响，可以选择裸鼠。因此，我们在选择乳腺癌动物模型的时候要根据实验具体的需求而定。