李伟，王兆松，董秋萍，徐玥，陈永孜，许世磊

（天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津300060）

肺鳞状上皮细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LSCC）是原发性肺癌中常见的一种[1]，但其对放疗、化疗不敏感[1-2]。因此找到更好的治疗靶点，对于治疗肺鳞癌具有重要的意义。已有研究表明，HsamiR-144可以通过调控TIGAR基因来抑制肺癌的增殖并诱导肺癌细胞的凋亡和自噬[3]，miR-144可以通过影响GLUT1影响肿瘤的代谢[4-7]，还可以通过AP-4影响非小细胞肺癌的转移[8]。miR-144影响肿瘤的研究中往往只针对其中一个靶基因，而miRNA在细胞中通常会调控多种靶基因，目前对于肺鳞癌相关miR-144靶基因综合的研究还未见报道，本文采用多种生物信息学的手段，综合分析了miR-144的靶基因及其相关的一些生物学特征信息，并依据TCGA中肺鳞癌患者的数据，深入分析了miR-144靶基因的相关信息，以期为其在肺鳞癌治疗方面的作用提供理论支持[9]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 数据材料 通过网站 UCSC Xena（https：//xenabrowser.net/datapages/）下载已经标准化处理的TCGA数据库中肺鳞状细胞癌患者数据（更新时间2016年4月）。

1.1.2 分析软件及数据库 SPSS 19.0统计分析软件，GraphPad Prims 7统计分析软件，Cytoscape 3.5.0系统生物学分析软件（http：//www.cytoscape.org/）；miRNA 靶基因数据库 Targetscan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）、TargetMiner （http：//www.isical.ac.in/～bioinfo_miu/targetminer20.htm）、miRDB（http：//www.mirdb.org/miRDB/）、PicTar （http：//pictar.mdcberlin.de/）；靶基因综合分析网站 Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）；DAVID信号通路分析网站（https：//david.ncifcrf.gov/）。

1.2 方法交叉表分析肺鳞癌患者 miR-144表达量与性别、年龄的相关性，并分析表达量与总生存率（overall survival，OS） 间关系并作图；通过Targetscan、Targetminer、miRDB 和 PicTar数据库预测miR-144靶基因，利用Venny 2.1软件综合分析4个数据库的结果并预测得到miR-144的候选靶基因；使用GraphPad Prims 7软件对患者的癌与癌旁组织基因表达数据进行配对样本t检验，分析靶基因在组织间的表达差异；使用BinGo插件对靶基因进行GO（gene ontology）富集分析；DAVID分析靶基因参与的信号通路。

2 结果

2.1 miR-144与患者总生存率间关系 下载并筛选出458例TCGA中收录了miR-144的表达量及OS的肺鳞癌病例。简单整理数据发现，458例患者中miR-144的最高表达量10.19，最低表达量为2.29，中位数为 6.277，均值为 6.256，方差为 2.163。以其表达量中位数（6.277）为界限分为高表达组（共229例）和低表达组（229例）。年龄方面，40岁为其最低年龄，90岁为最大统计年龄，年龄中值为68岁，平均年龄67.55岁，方差73.612，按其中位数将所有统计患者分为低龄和高龄两组，交叉表分析发现miR-144表达量与患者年龄无必然联系（P＞0.05）。从性别方面分析，所有统计患者中，男性有338例，女性患者120例，交叉表分析发现miR-144表达量与性别也无必然联系（P＞0.05），具体结果见表1。

表1 肺鳞癌患者miR-144表达量与年龄、性别交叉表分析Tab 1 Cross-Tabulations analysis of miR-144 expression level and age,gender in patients with lung squamous cell

SPSS绘制miR-144表达量与总生存率的生存函数，分析发现miR-144高表达组的总生存率比低表达组的高，且P=0.003（小于0.05），生存函数图如图1所示。因此miR-144的高表达有利于延长肺鳞癌患者的总生存时间，并且这种影响与患者的年龄和性别无关。

图1 肺鳞癌患者miR-144表达量与总生存率分析Fig 1 MiR-144 expression and overall survival(OS)analysis in patients with lung squamous cell

2.2 miR-144在肺鳞癌患者与其正常组织间表达差异分析 对TCGA中的肺鳞癌患者数据进行分析筛选，得到了43例即收录了癌组织又收录相应的癌旁正常组织表达信息的患者，这43例癌组织的hsa-miR-144的表达均值为6.248 6，最大值为9.810 2，最小值 2.294 7，方差为 2.328 0；癌旁组织的hsa-miR-144的表达均值为9.517 2，最大值为12.085 4，最小值5.244 0，方差为1.806 4。使用GraphPad Prism 7对43对数据进行配对样本的t检验分析，得到如图2所示的点状图，肿瘤组织中miR-144的表达量远低于癌旁正常组织，并且其P＜0.000 1，提示miR-144的表达对于肿瘤的发生发展具有十分重要的意义。

图2 肺鳞癌患者癌与癌旁miR-144表达量分析（****：P＜0.000 1）Fig 2 Expression analysis of miR-144 in tumor and normal tissue from patients with lung squamous cell carcinoma(****：P＜0.000 1)

2.3 miR-144靶基因的预测 通常一个miRNA调控多靶基因的表达，不同数据库的预测会得到不同的结果，为了能准确地预测，综合多个数据库的预测结果，并将每个数据库中均出现的基因作为最终候选靶基因。

本 文 采 用 Targetscan、miRDB、Targetminer 和PicTar4个数据库预测miR-144靶基因，分别得到了1043、569、2228和397个靶基因。通过在线综合分析工具Venny 2.1综合分析并最终得到了一个共有72个基因的集合，如图3所示，这个集合中包括了 ABCA1、CAV2、HOXA10、MOB2、SS18、ZFX 等基因，因此，可以认为这72个基因是miR-144的候选靶基因。

2.4 肺鳞癌患者中miR-144靶基因的表达差异分析 分析肺鳞癌患者的癌与癌旁组织间所有靶基因的表达，通过表达差异分析，确定有显著性差异的基因为miR-144影响肺鳞癌进展的靶基因。筛选得到了TCGA数据库中36例肺鳞癌患者的配对表达数据，这些数据包含癌与癌旁组织的所有RNA测序数据，并已进行标准化处理。36例患者癌和癌旁正常组织的72个候选靶基因表达数据主要包括每个基因在癌与癌旁正常组织的极值、均值、方差。使用GraphPad Prims对上述72个基因在不同组织的表达进行配对样本的t检验，其中在肿瘤组织和配对的正常组织中表达具有明显的差异（P＜0.05）有45个基因，其中在癌旁组织中高表达的有30（66.67%）个，15（33.33%）个基因在肿瘤中高表达，见表2。

图3 miR-144靶基因分析示意图Fig 3 Illustration of miR-144 target gene analysis

表2 癌与癌旁正常组织miR-144靶基因表达差异情况Tab 2 The different expression of miR-144 target gene in tumor and normal tissue

2.5 miR-144靶基因GO注释分析 基因本体论（gene ontology，GO）是通过对基因及其产物在细胞中参与的生物学过程、组成成分以及分子功能对基因及产物进行描述。为进一步分析miR-144的靶基因在肺鳞癌发生发展中的作用，对筛选出的45个差异表达的靶基因通过分析软件Cytoscape的BiNGO插件进行GO注释富集分析，设置物种为人类（Homo sapiens），差异水平 0.05，注释文件选择所有（All）。结果显示可知，从细胞组成方面看部分靶基因参与细胞核以及星形微管、细胞质中颗粒等的组成。这些基因参与包括肌肉形成、胚胎发育、神经元迁移、上皮细胞增生、RNA转录等等多达50项生物学过程，另外还参与了代谢过程。从参与的分子学过程看主要行DNA结合功能，这有利于其参与RNA转录的过程，另外还有一些蛋白质的结合功能。2.6 miR-144靶基因KEGG通路分析 通过GO富集分析对miR-144靶基因的功能进行初步解析，但基因通常是通过参与机体的信号通路对生命活动进行调节的，本文通过DAVID对45个候选靶基因进行信号通路分析。其中16个靶基因参与了多达37个信号通路，FBXW11参与了7个信号通路，包括蛋白质泛素化降解，Wnt信号通路，Hedgehog信号通路，Hippo信号通路等，其中Wnt和Hippo信号通路对肿瘤的发生发展具有重要的影响。ETS1，CAV2参与的信号通路对肿瘤的迁移侵袭具有重要影响。

3 讨论

本文对miR-144的靶基因进行生物信息学分析，并联系肺鳞癌患者的临床及基因表达数据，以期能够对临床研究提供指导意义。一个miRNA往往会调控多个靶基因表达，笔者发现miR-144共有72个候选靶基因，其中45个在肺鳞癌患者癌与癌旁正常组织间表达差异明显。

GO富集分析发现miR-144靶基因的产物参与细胞核组成，另外还与星形微管、细胞质中颗粒形成有关。miR-144与肌肉的形成、个体胚胎发育、上皮细胞增生、RNA转录等生物学过程有关，其靶基因还参与了人体的新陈代谢过程[10-12]。分子功能中DNA结合，蛋白质结合等功能，都有利于其参与相应的生物过程[13-14]。

miR-144靶基因的KEGG通路分析可帮助我们更好地了解其在生命活动中参与的信号通路。miR-144可以通过影响Ras信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路等调控肺鳞癌的发生发展[15-16]，当miR-144的表达发生变化时，整个细胞中基因的表达发生变化，一系列的信号通路也随之变化，进而影响了肿瘤的进展过程。miR-144在正常组织中表达量高于癌组织，且其高表达可有效延长肺鳞癌患者的总生存时间，因此，综合分析miR-144靶基因的相关信息，可为深入研究其在肺鳞癌患者中的作用机制提供重要理论数据支持。