李显东　吕军　胡秀学

[摘要] 目的 研究L-精氨酸、不對称二甲基精氨酸（ADMA）和对称性二甲基精氨酸（SDMA）3种生物标志物来预测川崎病（KD）患儿的预后。 方法 选取2012年1月～2013年12月湖北省十堰市太和医院儿科住院的典型KD患儿39例作为病例组，采集静脉血，同时收集与之年龄相匹配的呼吸道感染伴有发热并排除了心肌受累患儿27例的静脉血浆作为对照组，测量病例组和对照组中L-精氨酸、ADMA和SDMA的血浆水平。 结果 静脉注射免疫球蛋白（IVIG）治疗前病例组KD1患儿的血浆L-精氨酸、ADMA和SDMA水平均低于对照组（P < 0.05或P < 0.01）。IVIG治疗后病例组不同治疗时间患儿的L-精氨酸、ADMA、L-精氨酸/ADMA比率（AAR）和精氨酸甲基化综合指数（AMI）比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。病例组KD1、病例组KD2、病例组KD3、病例组KD4患儿血浆SDMA水平均低于对照组（P < 0.01），但IVIG治疗前后的比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；病例组KD2、病例组KD3和病例组KD4患儿的AMDA/SMDA比率（ASR）均高于对照组与病例组KD1患儿（P < 0.01）。在病例组KD1患儿中，冠脉扩张患儿L-精氨酸水平高于无冠脉扩张患儿（P < 0.01）；在病例组KD2患儿及病例组KD3患儿中，冠脉扩张患儿L-精氨酸水平均低于无冠脉扩张患儿（P < 0.01）。 结论 L-精氨酸、ADMA和SDMA的水平可能与KD有关。低水平L-精氨酸及IVIG治疗后ASR与冠状动脉异常的KD患儿有关。

[关键词] 不对称二甲基精氨酸；对称性二甲基精氨酸；川崎病；L-精氨酸

[中图分类号] R5414.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（b）-0063-04

[Abstract] Objective To study the three biomarkers of L-arginine， asymmetric dimethylarginine （ADMA） and symmetric dimethylarginine （SDMA） are used to predict the prognosis of children patients with kawasaki disease （KD）. Methods From January 2012 to December 2013， 39 children with KD in Department of Pediatric in Taihe Hospital were selected as the case group， venous blood was collected， and at the same time， the plasma of 27 children patients matched with age was collected as control group， which of respiratory infection was accompanied by fever and exclusion of involvement of myocardium. The plasma levels of L-arginine， ADMA and SDMA were measured in the case group and control group. Results The plasma levels of L-arginine， ADMA and SDMA before intravenous immunoglobulin （IVIG） treatment of children in the case group KD1 were lower than those of control group （P < 0.05 or P < 0.01）. After IVIG treatment， the L-arginine， ADMA， L-arginine/ADMA ratio （AAR） and arginine methylation composite index （AMI） of different treatment time in case group were compared， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The plasma levels of SDMA of children in case group KD1， case group KD2， case group KD3， case group KD4 were all lower than the control group （P < 0.01）， but comparison of before and after IVIG treatment， the difference were not statistically significant （P > 0.05）. The AMDA/SMDA ratio （ASR） of children in case group KD2， case group KD3， case group KD4 were all higher than control group and case group KD1 （P < 0.01）. In the case group KD1， the L-arginine level of children with coronary artery dilation was higher than that in children without coronary artery dilatation （P < 0.01）， while in the case group KD2 and the case group KD3， the children patients with coronary artery dilation was lower than that in children without coronary artery dilatation （P < 0.01）. Conclusion The levels of L-arginine， ADMA and SDMA may be related to KD. Low level of L-arginine and ASR of after IVIG treatment are associated with children patients with abnormal coronary artery KD.

[Key words] Asymmetric dimethylarginine； Symmetric dimethylarginine； Kawasaki diseas； L- arginine

川崎病（kawasaki disease，KD）是一种以全身血管炎变为主要病理的急性发热性出疹性小儿疾病[1]。1967年日本川崎富作医生首次报道，本病可发生严重心血管病变，如动脉瘤、心肌炎、缺血性心脏病等而致死[2]。研究发现，内皮功能障碍（ED）是KD重要的病理基础[3]。内皮细胞产生的一氧化氮（nitric oxide，NO）作用于平滑肌细胞从而扩张血管，NO缺乏对ED疾病发生发展具有重要的促进作用。研究发现急性KD患儿NO代谢物NOx（亚硝酸盐+硝酸盐）浓度增加，血浆硝酸盐浓度在KD急性期和亚急性期增加[4]。不对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是一氧化氮合酶（NOS）的内源性抑制剂，ADMA通过与NOS的底物L-精氨酸竞争，抑制NO生成[5-6]。因此，血浆L-精氨酸/ADMA比率（AAR）可作为NO生物利用度的指标[6]。研究表明，ADMA/对称二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginine，SDMA）的比例可作为二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶（DDAH）的活性的间接指标，有助于了解疾病的发病机制[7]。本研究通过分析精氨酸甲基化综合指数[AMI=L-精氨酸/（ADMA+SDMA）]来阐明在KD的不同阶段是否有差异。现将报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般資料

选取2012年1月～2013年12月湖北省十堰市太和医院（以下简称“我院”）儿科住院并符合2002年日本制订的典型KD诊断标准[8-9]的患儿39例为病例组，采集静脉血，同时收集与之年龄相匹配的呼吸道感染伴有发热并排除了心肌受累患儿27例（患有上呼吸道感染和/或下呼吸道感染的患儿，包括急性咽炎，急性扁桃体炎，急性支气管炎，急性细支气管炎和咳嗽）的静脉血浆作为对照组。病例组男29例，女10例；年龄1～6岁，平均（1.78±0.2）岁。对照组男18例，女9例；年龄1～7岁，平均（2.01±0.32）岁。两组患儿性别、年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。所有患有KD的患儿均在我院接受静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）治疗。患儿首先用单剂量的IVIG（广东双林生物制药有限公司，批号：S20003024）治疗12 h，剂量为2 g/kg。阿司匹林（山西兰花七佛山制药有限公司，批号：H14023980）以3～5 mg/kg的剂量单次给药，并持续至所有炎症消失为止[10-11]。IVIG治疗前采集外周血样（为病例组KD1患儿），应用IVIG治疗3 d内作为急性期样本（为病例组KD2患儿），IVIG治疗后3周为亚急性期样本（为病例组KD3患儿），6～12个月作为慢性期样本（为病例组KD4患儿）。定义冠脉扩张（CAL）标准为冠状动脉内径至少为3 mm（如果受试者年龄5岁以上则为4 mm）或某段内径至少为超声心动图相邻段的1.5倍[1，12]。病例组共有15例患儿有冠脉扩张，24例患儿无冠脉扩张。所有患儿均签署知情同意书，并通过医院医学伦理委员会的审核。

1.2 方法

使用高效液相色谱HP系列1100（购自安捷伦科技公司）及邻苯二甲醛-3-巯基丙酸衍生化试剂测定血浆L-精氨酸、ADMA和SDMA水平[13]。100 μL血浆与4 μL 20 μmol/L L-精氨酸作为内标（Fluka，德国），350 μL 0.4 μmol/L硼酸盐缓冲液（pH 9）充分混匀，在Oasis MCX阳离子交换SPE柱（Waters，德国）上进行分离，洗涤用1 mL硼酸盐缓冲液洗涤1次，H2O每次1 mL冲洗3次，1 mL甲醇冲洗1次。用1 mL NH4OH/H2O/甲醇（10∶40∶50）混合洗脱液将样品洗脱，然后用60 μL的H2O复溶。回收率约为90%。将60 μL样品加入Agilent SB-C18柱（14～150 mm； Agilent Technologies，Inc）。流速1.2 mL/min，并在EX338：EM455测量荧光强度。L-精氨酸、ADMA和SDMA的标准品浓度范围各自为1～100、0.5～5和0.5～5 μmol/L。L-精氨酸、ADMA、SDMA的变异系数分别为4.1%、3.2%和5.9%。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与治疗前后病例组患儿L-精氨酸、ADMA、SDMA指标比较

病例组KD1患儿L-精氨酸血浆水平低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；病例组KD2患儿L-精氨酸血浆水平均高于对照组与病例组KD1患儿（P < 0.01）；病例组KD3患儿L-精氨酸血浆水平高于病例组KD1患儿（P < 0.01），但低病例组KD2患儿（P < 0.01）；病例组KD4患儿L-精氨酸血浆水平低于病例组KD2患儿（P < 0.01）。病例组KD1患儿ADMA血浆水平低于对照组（P < 0.01）；病例组KD2、病例组KD3、病例组KD4患儿ADMA水平均高于病例组KD1患儿（P < 0.01）；病例组KD4患儿ADMA血浆水平低于病例组KD3患儿（P < 0.01）。病例组KD1、病例组KD2、病例组KD3、病例组KD4患儿血浆SDMA水平均低于对照组（P < 0.01），但IVIG治疗前后的比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 对照组与治疗前后病例组患儿AAR、AMDA/SMDA比率（ASR）、AMI比较

病例组KD1患儿AAR、ASR和AMI与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；病例组KD2患儿AAR、ASR和AMI与对照组及病例组KD1患儿比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；病例组KD3患儿与KD4患儿的AAR、AMI均低于病例组KD2患儿（P < 0.01）；病例组KD2、KD3和KD4患儿的ASR均高于对照组与病例组KD1患儿（P < 0.01）。见表2。

2.3 冠状动脉扩展和无冠状动脉扩张患儿各指标比较

將15例有冠脉扩张和24例无冠脉扩张的患儿在各自组内进行ADMA、SDMA、AAR、ASR和AMI比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；在病例组KD1患儿中，冠脉扩张患儿L-精氨酸水平高于无冠脉扩张患儿（P < 0.01）；在病例组KD2患儿及病例组KD3患儿中，冠脉扩张患儿L-精氨酸水平均低于无冠脉扩张患儿（P < 0.01）。见表3。

3 讨论

本研究结果提示，病例组KD1患儿L-精氨酸血浆水平低于对照组（P < 0.05），IVIG治疗后L-精氨酸水平升高（P < 0.01）。一个可能的原因是KD患儿L-精氨酸从血浆进入内皮细胞合成NO，另一个可能的原因是血浆L-精氨酸水平的降低与全身性炎症直接相关。事实上，炎症过程通过增加精氨酸酶活性来降低L-精氨酸水平，该酶将L-精氨酸转化为L-鸟氨酸，并且通过γ+转运体系介导L-精氨酸转运到内皮细胞中从而导致L-精氨酸减少[14]。

ADMA由精氨酸残基通过蛋白质精氨酸甲基转移酶甲基化产生，然后蛋白水解，通过DDAH降解来清除等离子体[15]。病例组KD1患儿ADMA血浆水平低于对照组（P < 0.01），这与Straface等[16]结果一致。研究发现ADMA在NOS抑制剂中具有重要的作用，NOS通过形成活性氮使NO具有细胞毒性，并增加心血管风险[17]。

SDMA能够抑制细胞内L-精氨酸摄取及肾小管吸收精氨酸[18-20]。本研究提示病例组KD1患儿、病例组KD2患儿、病例组KD3患儿、病例组KD4患儿血浆SDMA水平均低于对照组（P < 0.01），并且IVIG治疗前后的比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。这一发现可能意味着KD患儿肾脏清除SDMA增加，通过蛋白质精氨酸甲基转移酶的产生减少，或增加其运输到细胞或组织。而且，持续血浆SDMA低水平提示KD患儿有较高的NO生物利用度，并且急性KD患儿在急性期和亚急性期血浆硝酸盐浓度增加。此外，高ASR具有低DDAH活动。本研究中KD患儿血浆SDMA水平持续降低提示NO生物利用度较低。

本研究具有一定的局限性。首先是样本量较少，其次是很多常规食用的食物中含有较多的精氨酸[19]，这可能对本研究有一定的影响。因此，需要进一步检测消耗较少量精氨酸（如红肉、海鲜、鸡蛋和坚果等）的KD患儿的各项指标。

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（收稿日期：2017-11-23 本文編辑：万 平）